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蛋白磷酸酶PPM1A对KAP1和SIRT1的调节作用

作　者: 吕雅
导　师: 王传贵
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物医学
关键词: ppM1A KAp1 SIRT1 蛋白磷酸酶转录中介因子去乙酰化
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

KAP1(又称TIF1β,TRIM28等)是一种转录中介因子,能介导多种转录调控过程。大量研究表明,KAP1在大多数情况下以共抑制因子的形式参与转录调控复合体的形成,其在精细胞发育、胚胎早期发育等生理过程中发挥了重要的调控作用。但是,调节KAP1自身活性的机制尚不明确。人类SIRT1基因是依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,也是一种新的抗肿瘤药物靶点。SIRT1的同源基因Sir2能够延长酵母、线虫、果蝇的寿命,在基因组稳定性、细胞代谢调节和衰老上起着不可缺少的作用,现已发现SIRT1能结合p53、E2F1、FOXO、NF-κB等非组蛋白,有抵抗氧化逆境、抑制肿瘤细胞凋亡和提高肿瘤细胞耐药性的作用。研究表明,SIRT1有着丰富的磷酸化修饰,明确磷酸化对SIRT1生物学功能的影响,对以SIRT1为靶点的药物开发具有重要意义。结合分子克隆、病毒包装、稳定单克隆细胞筛选、RNA干扰、免疫荧光、免疫共沉淀、Western Blot和荧光定量PCR等技术进行研究后,本文发现,丝/苏蛋白磷酸酶PPM1A是KAP1和SIRT1的特异位点去磷酸化酶,且其对后两者特异位点的去磷酸化能影响后两者的功能。过表达PPM1A能使KAP1 Ser473去磷酸化,而当PPM1A的表达被抑制后,UV诱导的KAP1磷酸化响应衰减变慢,KAP1的下游抑制基因表达增强。PPM1A和SIRT1两者结合,过表达PPM1A能使SIRT1 Thr 719去磷酸化,且使SIRT1对组蛋白H3的Lys18去乙酰化作用减弱。本文发现了PPM1A的两个新的底物,同时找到了调控KAP1和SIRT1功能的一个新的蛋白,完善了和PPM1A、KAP1、SIRT1三者有关的信号通路,为研究这三个蛋白提供了新的思路。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第一章前言  9-15
  第一节转录中介因子KAP1  9-11
  第二节组蛋白去乙酰化酶SIRT1  11-13
  第三节蛋白磷酸酶PPM1A  13-15
第二章材料与方法  15-44
  第一节实验材料  15-18
    1. 菌种和细胞株  15
    2. 质粒  15
    3. 酶和抗体  15-16
    4. 其他主要试剂和耗材  16-17
    5. 实验仪器设备  17-18
  第二节实验方法  18-44
    1. 课题研究路线  18
    2. shPPM1A克隆构建  18-21
    3. 重组质粒的转化和鉴定  21-22
    4. 质粒大量抽提  22-23
    5. 细胞总RNA的提取  23-24
    6. 逆转录反应(RT-PCR)  24-25
    7. 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)  25-27
    8. 细胞培养  27-28
    9. 细胞的转染  28-30
    10. 慢病毒的包装、感染和稳定单克隆细胞株的筛选  30-33
    11. 免疫荧光染色技术  33-34
    12. 免疫(共)沉淀技术  34-35
    13. Western blot技术  35-44
第三章结果与分析  44-52
  第一节 PPM1A和KAP1的关系研究  44-49
    1. PPM1A是KAP的磷酸酶  44-46
    2. 抑制PPM1A的表达对KAP1的功能有影响  46-49
  第二节 PPM1A和SIRT1的关系研究  49-52
    1. PPM1A是SIRT1的磷酸酶  49-51
    2. PPM1A能影响SIRT1去乙酰化活性  51-52
第四章总结和讨论  52-54
附录  54-61
  硕士期间科研成果  54-55
  1. 常用试剂配方  55-56
  2. 质粒大量抽提试剂配方  56-58
  3. Western Blot中所用溶液  58-59
  4. 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  59
  5. IF实验中所用溶液  59-60
  6. 英文名词和缩写  60-61
References  61-65
致谢  65

蛋白磷酸酶PPM1A对KAP1和SIRT1的调节作用

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