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pRB与Smad3的相互作用及结构生物学研究

作　者: 程译文
导　师: 冯新华
学　校: 浙江大学
专　业: 细胞生物学
关键词: pRB Smad3 TGF-β 蛋白相互作用结构生物学
分类号: Q257
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 26次
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内容摘要

转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路在细胞生长、分化、迁移和凋亡过程中具有很重要的作用。在此信号通路中,TGF-β先通过其受体磷酸化受体调节型Smad(receptor regulated Smad, R-Smad),然后磷酸化的R-Smad与共同介导型Smad(common mediator Smad, Co-Smad)形成复合物,复合物入核直接参与目的基因的调节,从而调控细胞的生长和分化。TGF-β信号通路通过上调细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(CKI)的表达,包括INK4家族的p15Ink4B和Cip/Kip家族的p21Cip1,来抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的活性,从而使肿瘤抑制因子pRB(retinoblastoma protein)的磷酸化作用受阻。非磷酸化状态的pRB能够结合转录因子E2F,抑制E2F的转录活性,从而使细胞周期停滞在G1期。本研究在探究pRB的生理功能过程中,惊奇地发现pRB能够与Smad3直接相互作用。体内外试验验证了pRB与Smad3存在相互作用。应用免疫共沉淀试验检测,结果显示pRB与Smad3在哺乳动物细胞内存在相互作用。通过GST沉淀检测,结果显示pRB与Smad3在体外存在相互作用。上述结果验证了pRB与Smad3在体内外存在相互作用。体内外试验验证了pRB与Smad3相互作用的结构域。结果显示pRB与Smad3的相互作用发生在pRB口袋结构中的B亚结构域及C端结构域与Smad3的MH2结构域。通过点突变试验验证了存在于Smad3上介导pRB与Smad3相互作用的至关重要的氨基酸——位于第282位的丙氨酸。本研究做了单点突变(S236A、L285M、A282T)和双点突变(I419V/V424M),通过免疫共沉淀或GST沉淀检测,结果显示在这些突变中,只有A282T能破坏pRB与Smad3的相互作用。通过一段体外合成的具有细胞渗透性并且含有Ala282的短肽的竞争抑制试验,进一步验证A1a282在pRB与Smad3相互作用中的重要性。通过免疫共沉淀试验,结果显示,该短肽能够特异地抑制pRB与Smad3的相互作用。从结构生物学的角度探讨pRB与Smad3的相互作用。通过基因克隆；原核表达pRB的口袋结构域、pRB的C端结构域和Smad3的MH2结构域；运用亲和层析、分子排阻凝胶层析纯化得到蛋白；体外形成复合物。但是很遗憾,我们并没有得到三者的复合物。本论文的研究结果首次报道了pRB与Smad3的相互作用,推测pRB通过与Smad3相互作用可能参与TGF-β信号通路的调控,进一步的深入研究将有助于了解TGF-β信号通路对细胞周期的调控机制。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
目次  10-12
第一部分 pRB与Smad3相互作用的研究  12-40
  1 引言  12-18
    1.1 TGF-β/Smad信号通路  12-14
    1.2 pRB/E2F信号通路  14-16
    1.3 TGF-β/Smad和pRB/E2F  16-18
  2 实验材料与方法  18-26
    2.1 实验材料  18-20
    2.2 实验方法  20-26
  3 实验结果  26-33
    3.1 pRB-Smad3的相互作用  26-27
    3.2 pRB-Smad3相互作用结构域的鉴定  27-28
    3.3 鉴定介导pRB-Smad3相互作用的氨基酸  28-32
    3.4 Peptide竞争抑制实验  32-33
  4 讨论  33-35
  参考文献  35-40
第二部分 pRB与Smad3相互作用的结构生物学研究  40-62
  1 引言  40-46
    1.1 结构生物学简介  40-41
    1.2 pRB的结构学研究进展  41-44
    1.3 Smad的结构学研究进展  44-46
  2 实验材料与方法  46-53
    2.1 实验材料  46-47
    2.2 实验方法  47-53
  3 实验结果  53-58
    3.1 pRB pocket结构域的纯化结果  53-54
    3.2 pRB C端结构域的纯化结果  54-55
    3.3 Smad3 C端结构域的纯化结果  55-56
    3.4 RBAB/RBC/S3C混合FPLC  56-58
  4 讨论  58-60
  参考文献  60-62
综述  62-69
  参考文献  67-69
作者简历及在学期间所取得的科研成果  69

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生理学 > 细胞内的信息传递
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