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骨髓间充质干细胞诱导分化及其对大鼠脑梗死恢复期治疗作用的实验研究

作　者: 刘艳
导　师: 张颖冬
学　校: 南京医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 神经节苷脂-1 骨髓间充质干细胞 分化 神经营养因子 脑梗死 神经功能 神经分化 血管再生
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


第一部分神经节苷脂-1诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的作用研究目的：探讨神经节苷脂-1 (GM1)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经细胞的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠骨髓MSCs，体外扩增三代，加入含有100μg/ml GM1试剂的培养液诱导其分化。用倒置显微镜观察诱导分化后MSCs的形态，免疫组化染色检测其神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。逆转录PCR检测神经营养因子(NGF) mRNA和脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA的表达水平，并与胎牛血清(FBS)对照组和空白对照组进行比较。结果：GM1诱导后的细胞胞体变圆，突起增加，部分突起相互联结成网状，NSE阳性的细胞占全部细胞的比例为(29.47%±3.26)%，GFAP阳性的细胞所占比例为(2.32±0.18)%，FBS组和DMEM组分别有(6.97±0.56)%和(10.6±0.75)%的细胞内NSE表达阳性，(1.41±0.35)%和(1.21±0.35)%的细胞内GFAP表达阳性。NGFmRNA和BDNF mRNA水平显著高于FBS对照组(P<0.01)和空白对照组(P<0.05)。结论：GM1在体外能诱导MSCs分化为神经元样细胞。第二部分腹腔和尾静脉注射骨髓间充质干细胞对大鼠脑梗死恢复期疗效对比研究目的：分别以腹腔和尾静脉途径注射培养骨髓间充干细胞治疗大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠，观察MSCs移植对大鼠缺血性脑损伤恢复期的神经功能恢复作用，探讨其作用机制，比较及筛选移植途径。方法：取体重180~200 g Sprague-Dawley (SD)大鼠长骨的骨髓细胞，把MSCs分离出来后进行传代和扩增，在MSCs中掺入10 mg/L的5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)进行标记，用于动物实验。用改良的Zea Longa线栓法制作MCAO脑缺血再灌注模型，并采用6级评分法初步判断脑缺血的程度。将45只造模成功的SD大鼠随机分为3组：尾静脉注射治疗组、腹腔注射治疗组和0.01M PBS注射对照组，每组各15只。各组又分别在治疗后第7、14和21天三个时间点处死大鼠取脑。尾静脉注射治疗组和腹腔注射治疗组在造模21天后分别经尾静脉和腹腔途径将标记BrdU的MSCs悬液植入脑缺血大鼠体内。然后进行如下处理：①比较各组大鼠在注射后不同时间点(MCAO术前1天、术后第1和21天、治疗后第3、7、14和21天)的神经功能评分(NSS)的差异；②各组大鼠分别于注射后7、14、21天三个时间点处死，灌注取脑，固定、包埋、切片；③以BrdU、微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为增殖、分化的标记物，免疫组化染色方法检测BrdU阳性细胞、BrdU+MAP-2与BrdU+GFAP的双阳性细胞；④检测血管生成素Angiogenin的水平，评估血管再生程度；⑤探讨不同途径注射的MSCs在脑缺血大鼠的脑内存活、迁移及分化情况。结果：通过换液、传代，骨髓MSCs被分离和纯化，细胞形态为梭形，呈漩涡状。大鼠用线栓法制作MCAO模型后，表现为线栓动脉对侧的肢体瘫痪。各组大鼠在造模后第1天的NSS评分值达高峰，各组之间无统计学差异(P>0.05)，随后各组大鼠的神经功能均逐渐改善；尾静脉注射治疗组和腹腔注射治疗组较之PBS注射对照组加速改善，在治疗后第21天尾静脉治疗组的神经功能缺损严重程度评分显著低于PBS注射对照组(P<0.05)和腹腔注射治疗组(P<0.05)，腹腔注射治疗组和PBS注射对照组相比则没有明显差异。治疗后第7天、14天和21天的脑组织均有BrdU阳性细胞，弥散分布于梗死同侧纹状体、海马和皮层，梗死对侧明显少于患侧。部分BrdU阳性细胞表达神经元特异性的(MAP-2)或胶质细胞特异性的(GFAP)。各组纹状体、海马和皮层均可见血管生成素Angiogenin表达阳性。结论：脑梗死恢复期行细胞移植治疗能显著改善大鼠神经功能。MSCs经腹腔或者尾静脉注射后均能进入脑组织，通过促进神经再生和血管再生等机制改善神经功能缺损，MSCs移植后可促进脑内Angiogenin的分泌，促进MCAO后大鼠神经功能恢复。静脉注射的疗效优于腹腔注射。

全文目录


中英文对照缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要（SUMMARY）  8-11
引言  11-13
第一部分 神经节苷脂-1 诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的作用研究  13-22
  前言  13
  材料与方法  13-18
  结果  18-20
  讨论  20-22
第二部分 腹腔和尾静脉注射骨髓间充质干细胞对脑梗死恢复期疗效的对比研究  22-37
  前言  22
  材料与方法  22-27
  结果  27-28
  讨论  28-37
结论  37-38
参考文献  38-44
综述  44-54
  参考文献  50-54
附图  54-57
攻读学位期间发表文章情况  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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