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人源性D-二聚体及其抗体cDNA制备研究

作　者: 张驰
导　师: 宁勇
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: D-二聚体 凝胶过滤层析 蛋白质提纯 抗体
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：为弥补用单克隆抗体制备D-二聚体抗体方法的不足,寻找高特异性D-二聚体抗原决定簇,本课题通过制备人源性D-二聚体粗品用来免疫小鼠,获得其抗体cDNA,为下一步D-二聚体噬菌体抗体库的构建与筛库打下基础。方法：采用冻融法从新鲜人血浆中提取纤维蛋白原。将人纤维蛋白原溶液与正常人新鲜血浆(提供制备交联纤维蛋白的凝血酶与ⅩⅢ因子)混合并加入咪唑缓冲液(IBS)制备得人交联纤维蛋白,再经人纤维蛋白溶解酶水解。产物通过交联葡聚糖凝胶(Sephadex) G-150凝胶过滤制备获得D-二聚体的粗品。经过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白纯度后,加入等体积完全福氏佐剂用于免疫BALB/C小鼠。再每隔一周用D-二聚体的粗品与等体积的福氏不完全佐剂混合加强免疫共3次后取脾、低温碾磨、匀浆,提取脾脏细胞总RNA,逆转录为cDNA。结果：1.采用冻融法从新鲜人血浆中提取的纤维蛋白原沉淀,经咪唑缓冲液溶解后加入新鲜人血浆,37℃水浴10分钟纤维蛋白原完全凝固成白色胶体状。经尿素溶解实验确定为交联纤维蛋白胶体。2.将交联纤维蛋白胶体置于pH7.6的TBS缓冲液中,加入纤维蛋白溶解酶。经过37℃摇床水解48小时,交联纤维蛋白胶体基本完全降解为可溶性降解产物。溶液经冷干78小时后转为微黄色完全溶解液体。3.获取的液体经非还原性SDS-PAGE,考马斯亮蓝R250染色,脱色显色后显示出几条清晰的条带。按照蛋白质Marker的分子量对照,可以认为获取液所含大部分蛋白质约为190KDa。与D-二聚体的分子量大小一致,说明酶解条件合适。4.获取液再以每小时10m1的速度,用pH7.6的TBS缓冲液平衡,上样,凝胶过滤。每10分钟获取一次滤过液,收集完后透析,去盐,再进行SDS-PAGE,显示经β-巯基乙醇还原后出现90、80KDa的蛋白质碎片,应为D-二聚体的D碎片及β-链。5.取得的D-二聚体粗品经微孔滤膜过滤除菌免疫小鼠,四周后提取小鼠脾脏细胞总RNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,提取的总RNA三条带两条清晰可见,符合逆转录为cDNA的标准。结论：本课题从新鲜人血浆中提取纤维蛋白原,制备形成人交联纤维蛋白胶体,通过蛋白酶降解、凝胶过滤后分离提纯、免疫小鼠提取总RNA,逆转录形成cDNA。后期课题可运用RT-PCR技术获得抗D-二聚体抗体可变区VL、VH的基因,构建噬菌体D-二聚体抗体文库。本实验成功的分离提纯了D-二聚体粗品,为免疫小鼠提供了抗原。为成功构建全套抗D-二聚体噬菌体抗体库打下了基础。同时也为人血浆蛋白分离提纯提供了相关经验。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略语表  11-12
前言  12-14
一、D-二聚体的制备  14-19
  1. 材料与仪器  14-15
    1.1 新鲜人全血  14
    1.2 主要试剂  14
    1.3 主要配制试剂  14
    1.4 主要仪器  14-15
  2. 操作方法  15-16
    2.1 人纤维蛋白原的提取  15
    2.2 人交联纤维蛋白的制备  15
    2.3 交联纤维蛋白胶体酶解  15
    2.4 凝胶柱的准备  15-16
    2.5 D-二聚体粗品的制备  16
  3. 结果  16
  4. 讨论  16-19
二、D-二聚体蛋白质的检测  19-24
  1. 材料与仪器  19-20
    1.1 D-二聚体粗品  19
    1.2 主要试剂  19
    1.3 主要配制试剂  19-20
    1.4 主要仪器  20
  2. 操作方法  20-21
    2.1 配制SDS-PAGE分离胶  20
    2.2 配制SDS-PAGE浓缩胶  20
    2.3 加样电泳  20-21
    2.4 染色脱色  21
    2.5 微孔过滤除菌  21
  3. 结果  21-22
  4. 讨论  22-24
三、免疫动物  24-26
  1. 材料与器材  24
    1.1 BALB/C小鼠  24
    1.2 主要试剂  24
    1.3 主要试剂配制  24
    1.4 主要器械  24
  2. 操作方法  24-25
    2.1 乳化抗原  24
    2.2 第一次免疫  24-25
    2.3 第二次免疫  25
    2.4 分离血清  25
  3. 结果  25
  4. 讨论  25-26
四、小鼠cDNA的合成  26-32
  1. 材料与仪器  26-27
    1.1 小鼠的脾组织  26
    1.2 主要试剂  26
    1.3 主要配制试剂  26
    1.4 主要仪器  26-27
  2. 操作方法  27-29
    2.1 取小鼠脾脏  27
    2.2 脾脏细胞总RNA的提取  27-28
    2.3 RNA的鉴定  28
    2.4 cDNA的合成  28-29
  3. 结果  29
  4. 讨论  29-32
结语  32-34
参考文献  34-36
综述  36-44
  参考文献  41-44
附图  44-45
致谢  45

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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