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TLR4/PI3K信号相关分子在气道上皮细胞诱导的哮喘气道平滑肌细胞迁移中的作用及机制研究

作　者: 苏海英
导　师: 莫碧文
学　校: 桂林医学院
专　业: 呼吸内科学
关键词: TLR4 细胞迁移气道上皮细胞气道平滑肌细胞支气管哮喘
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞因子参与的慢性气道炎症性疾病,气道重构和气道炎症是哮喘的特征性病理改变。气道重构是哮喘发病的重要环节,但其发病机制至今尚未完全明确。支气管上皮作为气道内的物理屏障,当其受到各种损伤因素作用后,不仅其屏障及保护作用减退,还会释放TNF-a、RANTES、IL-8等多种细胞因子,诱导气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cells,ASMCs)跨膜迁移,在哮喘气道重构中发挥重要作用。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-Kinases,PI3K)参与多种疾病过程,与哮喘密切相关。我们拟观察气道上皮细胞在基础状态及干预状态下的分泌功能,检测其对哮喘ASMCs跨膜迁移功能的影响,进而更科学、全面的评价哮喘状态下ASMCs的功能变化,通过使用抗TLR4抗体、渥曼青霉素和二硫代氨基吡咯烷(PDTC)干预,以探讨TLR4/PI3K相关信号分子在气道上皮细胞诱导的ASMCs迁移功能中的作用。同时,通过建立哮喘大鼠模型,我们尝试探讨传统中药合剂小青龙汤对哮喘TLR4、p-Akt表达及ASMCs迁移的影响,以寻找哮喘治疗的新药物。方法:我们将建立大鼠哮喘模型,分离哮喘气道平滑肌细胞进行原代培养,并取肺组织,用图象分析软件测量气道壁厚度,使用免疫组织化学、ELISA、改良Boyden小室等方法,用TNF-α、抗TLR4抗体、渥漫青霉素、PDTC和小青龙汤等作为工具药,探讨哮喘状态下TLR4/PI3K信号相关分子在哮喘气道上皮诱导的气道平滑肌细胞迁移中的作用及其机制。结果:⑴与正常对照组相比,各浓度TNF-a组IL-8和RANTES的分泌水平显著增加(P<0.01)。⑵与正常对照组相比,TNF-a组RTE培养上清液诱导ASMCs跨膜迁移水平显著增高(P<0.01),并与上清液中IL-8和RANTES的变化水平趋势相一致。⑶与正常对照组相比,TNF-α+抗TLR4抗体组、TNF-α+渥漫青霉素组和TNF-α+PDTC组ASMCs跨膜迁移水平显著减低(P<0.01)。⑷与TNF-α+渥漫青霉素组相比,TNF-α+渥漫青霉素组+PDTC组ASMCs跨膜迁移水平显著降低(P<0.05)。⑸与正常对照组相比,哮喘4周组、哮喘8周组、小青龙汤4周组和8周组大鼠的管壁面积、平滑肌面积较正常对照组均显著增大(P<0.01),平滑肌距基底膜的距离显著减小(P<0.01)。⑹与哮喘8周组相比,哮喘4周组、小青龙汤4周的管壁面积和平滑肌面积显著减小,平滑肌距基底膜的距离显著增大(P<0.05)。⑺与哮喘4周组和哮喘8周组相比,小青龙汤8周组的管壁面积明显减小,平滑肌距基底膜的距离明显增大(P<0.05)。⑻与正常对照组相比,哮喘4周组、哮喘8周组、小青龙汤4周组和小青龙汤8周组TLR4和p-Akt的表达量显著增高(P<0.01)。⑼与哮喘8周组相比,哮喘4周组、小青龙汤4周组和小青龙汤8周组TLR4和p-Akt的表达量显著降低(P<0.01)。结论:⑴TNF-a可诱导哮喘气道上皮细胞分泌IL-8和RANTES等多种细胞因子和趋化因子,并与浓度有一定的相关性,从而参与哮喘的气道炎症和气道重构。⑵哮喘气道上皮细胞可能通过分泌IL-8、RANTES等多种细胞因子作用于ASMCs,引起细胞的跨膜迁移。⑶TLR4、PI3K和NF-κB可能参与哮喘上皮细胞诱导的ASMCs跨膜迁移,上皮细胞可能通过分泌趋化因子等细胞因子,后者激活TLR4相关信号分子引起ASMCs跨膜迁移,从而加重哮喘气道重构。⑷小青龙汤可能通过抑制TLR4和p-Akt的表达从而抑制哮喘气道平滑肌的迁移,在哮喘气道重构方面发挥一定的作用。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-14
前言  14-17
第一部分 TLR4/PI3K 信号相关分子在气道上皮细胞诱导的哮喘气道平滑肌细胞迁移功能中的影响  17-28
  1.1 材料与方法  17-20
    1.1.1 主要材料和仪器  17
    1.1.2 方法  17-20
      1.1.2.1 大鼠哮喘模型的建立  17
      1.1.2.2 原代哮喘大鼠气道平滑肌的分离与培养  17-18
      1.1.2.3 ASMCs 的鉴定  18-19
      1.1.2.4 上皮源性细胞培养上清液的制备  19
      1.1.2.5 酶联免疫吸附试验测定以上各组干预后的 RTE 培养上清液中IL-8 和RANTES 的含量  19
      1.1.2.6 TLR4、P13K 和 NF-κB 对RTE 培养上清液诱导的 ASMCs 跨膜迁移的影响  19-20
      1.1.2.7 统计学分析  20
  1.2 结果  20-24
    1.2.1 ASMCs 光学显微镜下  20-21
    1.2.2 免疫细胞化学检测α-SM-actin 的表达  21
    1.2.3 酶联免疫吸附试验测定 RTE 细胞培养上清液中 IL-8、RANTES的含量  21-22
    1.2.4 TLR4、P13K 和 NF-κB 对RTE 上清液诱导的 ASMCs 跨膜迁移的影响  22-24
  1.3 讨论  24-28
第二部分 TLR4、p-Akt 在哮喘大鼠气道平滑肌迁移的作用及小青龙汤对其影响的研究  28-43
  2.1 材料和方法  28-30
    2.1.1 材料  28
      2.1.1.1 实验动物  28
      2.1.1.2 主要试剂和设备  28
    2.1.2 研究方法  28-30
      2.1.2.1 小青龙汤的制备  28
      2.1.2.2 实验动物分组  28
      2.1.2.3 哮喘模型的建立  28-29
      2.1.2.4 气道阻力测定及组织标本制作  29
      2.1.2.5 气道壁 HE 染色及 EOS 观察  29
      2.1.2.6 TLR4 和p-Akt 免疫组织化学染色  29-30
      2.1.2.7 支气管-肺组织病理学观察和图像分析  30
    2.1.3 统计学处理  30
  2.2 结果  30-34
    2.2.1 各组大鼠气道阻力的比较  30-31
    2.2.2 HE 染色及光镜观察  31-32
    2.2.3 支气管-肺组织图像分析  32-33
    2.2.4 气道平滑肌 TLR4、p-Akt 表达的变化  33-34
  2.3 讨论  34-38
  参考文献  38-43
附图  43-46
综述  46-72
  1.TLRs 的分布及配体  48-50
    1.1 TLRs 的分布  48
    1.2 TLRs 配体  48-50
  2.TLRs 介导的信号传导途径  50-53
    2.1 MyD88 依赖途径  50-51
    2.2 非MyD88 依赖途径  51-53
    2.3 P13K 信号通路  53
  3.TLRs 与哮喘炎症细胞迁移  53-60
    3.1 TLRs 与树突状细胞  54-55
    3.2 TLRs 与中性粒细胞  55-58
    3.3 TLRs 与骨髓间充质干细胞  58-59
    3.4 TLRs 与平滑肌细胞  59-60
  4. 结论与展望  60-61
  参考文献  61-72
致谢  72-73
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