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中国叶螨DNA条形码的研究及其系统发育分析

作　者: 李国庆
导　师: 洪晓月
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: DNA条形码叶螨 COI ITS1 ITS2 28S 鉴定系统发生分析
分类号: S433.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

叶螨属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae,是一种危害果蔬和温室植物的世界范围的重要经济害虫。叶螨科物种鉴定的困难在于有限的形态学特征,而且物种之间的这些特征具有高度的相似性,这种情况在叶螨属内尤为普遍。另外,只有很少一部分分类学家专于叶螨的形态学鉴定,而且数量日趋减少。基于DNA序列对叶螨科物种的鉴定,相对于传统的形态学鉴定而言具有特殊的意义。它的优点是迅速、简单、可靠。DNA条形码技术是利用分子标记的序列差异将物种鉴定到种水平的一种方法。本研究通过形态学关键特征对叶螨科九个物种进行了鉴定,并对其线粒体COI,核糖体ITS1、ITS2及28S序列进行测定和研究。旨在探索COI、ITS1、ITS2和28S序列作为DNA条形码是否可以对叶螨科九个物种准确鉴定和进行系统发生分析。另外,我们大量检测了种内种间的序列差异,用于分析叶螨的种内种间关系。DNA条形码技术是一种利用线粒体COI 5’端的序列差异将物种鉴定到种水平的方法,线粒体COI基因由于种间较高的多态性,在物种鉴定方面显示了独特的优势。测定线粒体COI部分序列来阐述叶螨科4个属9个物种的系统发生关系。研究结果证实了形态学上定义的4个属叶螨属Tetranychus,全爪螨属Panonychus,双叶螨属Amphitetranychus和岩螨属Petrobia分别形成一个单系,然而在叶螨属内截形叶螨Tetranychus truncatus,朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus和二斑叶螨Tetranychus urticae的系统发生地位并没有被很好地解决。总体上属间差异大于种间差异,种间差异大于种内差异,但朱砂地理种群间的遗传距离最大的为0.1018,数据统计显示河南和云南朱砂种群与其它5个地理种群间差异较大,表明朱砂种群可能存在隐含种。之前的研究表明利用核糖体序列间的差异可以对物种进行鉴定,甚至是相近物种、复杂物种和地理种群的鉴定。我们选择了rDNA的ITS1, ITS2区段作为分子标记,对中国叶螨科4个属9个种23个种群进行研究,从而探索核糖体ITS的序列是否适合于叶螨科物种的分子鉴定。基于ITS1的序列差异属间大于种间,种间大于种内。种间差异全部大于2%,而酢浆草岩螨的5个地理种群的序列完全一致,二斑叶螨的5个地理种群的平均遗传距离为0.018,但数据统计显示河南和云南种群与其它5个地理种群间差异较大。对ITS2序列测定研究表明各物种除了苹果全爪螨P. ulmi和柑橘全爪螨P. citri处于同一进化枝上,其它物种都以较高的置信度形成一个单系。但是二斑叶螨,截形叶螨及土耳其斯坦叶螨的两两核苷酸差异小于2%,而朱砂叶螨的不同地理种群的核苷酸差异大于2%。基于核糖体ITS1和ITS2分析表明：尽管叶螨属内朱砂叶螨和二斑叶螨的系统发生地位没有很好地解决,但形态学上定义的四个属和大部分种被很好地区分开来。通过研究核糖体28S-rRNA的D1-D2部分序列来阐述叶螨科4个属9个物种的系统发生关系。研究结果证实了形态学上定义的四个属叶螨属,全爪螨属,双叶螨属和岩螨属分别形成一个单系,然而在叶螨属内及全爪螨属内各物种的系统发生地位并没有被很好地解决。基于核糖体28S-rRNA序列无法将叶螨鉴定到种水平,但对于属水平上的鉴定却提供了重要的参考。本研究旨在探索是否可以利用线粒体COI及核糖体ITS1,ITS2,28S作为分子条形码用于鉴定中国叶螨科4个属的9个常见物种,分析它们的系统发生关系,从而给叶螨科DNA条形码的研究提供一定的理论参考。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-27
  1 DNA条形码的综述  11-17
    1.1 DNA条形码研究的发展历史  11-12
    1.2 DNA条形码的原理  12
    1.3 DNA条形码的优势  12-13
    1.4 DNA条形码的研究概况  13-17
      1.4.1 DNA条形码在不同类群中的研究  13-14
      1.4.2 DNA条形码的部分研究结论  14-15
      1.4.3 DNA条形码发展趋势和有关争议  15-17
  2 基因组DNA在蜱螨研究中的应用  17-24
    2.1 线粒体DNA在蜱螨中的应用  18-22
      2.1.1 线粒体DNA的特点  18-19
      2.1.2 线粒体DNA多态性研究技术  19-20
        2.1.2.1 直接测序法  19-20
        2.1.2.2 RFLP法  20
      2.1.3 线粒体DNA条形码在蜱螨研究中的应用  20-22
    2.2 核糖体DNA在蜱螨中的应用  22-24
      2.2.1 核糖体DNA的特点  22-23
      2.2.2 核糖体DNA多态性研究技术  23
        2.2.2.1 直接测序法  23
        2.2.2.2 RFLP法  23
      2.2.3 核糖体DNA条形码在蜱螨研究中的应用  23-24
  3 叶螨的经济意义  24-27
第二章线粒体DNA-COI作为DNA条形码对叶螨的鉴定及其系统发育分析  27-39
  1 材料与方法  28-32
    1.1 供试材料  28-30
    1.2 叶螨总DNA的提取  30
    1.3 PCR扩增体系和条件  30
    1.4 PCR产物纯化  30-31
    1.5 连接和转化反应  31-32
    1.6 序列测定和分析  32
  2 结果与分析  32-36
    2.1 基于COI的序列差异及饱和度分析  32-34
    2.2 基于COI所构建的系统发育树  34-36
  3 讨论  36-39
第三章核糖体DNA-ITS1作为DNA条形码对叶螨的鉴定及其系统发育分析  39-47
  1 材料与方法  40-42
    1.1 供试材料  40-41
    1.2 叶螨总DNA的提取  41
    1.3 PCR扩增体系和条件  41-42
    1.4 序列测定与分析  42
  2 结果与分析  42-45
    2.1 基于ITS1的序列差异及饱和度分析  42-44
    2.2 基于ITS1构建的系统发育树  44-45
  3 讨论  45-47
第四章核糖体DNA-ITS2作为DNA条形码对叶螨的鉴定及其系统发育分析  47-55
  1 材料与方法  48-50
    1.1 供试材料  48-49
    1.2 叶螨总DNA的提取  49
    1.3 PCR扩增体系和条件  49-50
    1.4 序列测定与分析  50
  2 结果与分析  50-53
    2.1 基于ITS2的序列差异及饱和度分析  50-52
    2.2 基于ITS2构建的系统发育树  52-53
  3 讨论  53-55
第五章核糖体28S-rRNA作为DNA条形码对叶螨的鉴定及其系统发育分析  55-63
  1 材料与方法  56-58
    1.1 供试材料  56-57
    1.2 叶螨总DNA的提取  57
    1.3 PCR扩增体系和条件  57-58
    1.4 序列测定与分析  58
  2 结果与分析  58-61
    2.1 基于28S-rRNA的序列差异及饱和度分析  58-60
    2.2 基于28S-rRNA构建的系统发育树  60-61
  3 讨论  61-63
全文总结  63-65
参考文献  65-73
学术论文发表情况  73-75
致谢  75

中国叶螨DNA条形码的研究及其系统发育分析

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