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重组AiiA蛋白表达及其酶学性质研究

作　者: 林丽玉
导　师: 杨梅
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物
关键词: AiiA蛋白 表达条件优化 酶动力学 定点突变 真核表达
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


革兰氏阴性细菌是主要的植物致病菌,而其致病菌主要是通过细菌的群体感应(quorum sensing, QS)系统来调控其致病因子的表达,而N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHL)是QS系统的关键信号分子,当AHL在相对封闭的环境中不断积累,其浓度到一定阈值时就能够激活QS系统的致病因子的启动子,促进致病因子的表达,产生致病性并出现相关症状。因此降低AHL的浓度成为防治这类病害的关键。苏云金芽孢杆菌中的aiiA基因表达的AiiA蛋白能够水解AHL内酯环,降低相对封闭环境中的AHL的量,从而降低AHL的浓度,能阻滞甚至破坏革兰氏阴性细菌的群体感应系统,从而达到控制革兰氏阴性细菌病害的目的,有望成为生物防治革兰氏阴性病原菌的一种生物防治的新手段。采用不同发酵培养基及诱导条件对重组工程菌E.coli-BL21 (DE3)-pET29a-aiiA表达可溶性AiiA蛋白的影响做了分析。确定了E.coli-BL21 (DE3)-pET29a-aiiA最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,表达条件优化表明,在250ml的三角锥形瓶中装70ml的牛肉膏蛋白胨培养液,培养液中加入20mmol/L Na2HPO4,pH值为7.0,在对数生长初期(OD600为0.5)用浓度为0.6mmol/L IPTG诱导20h时,可溶性的AiiA蛋白相对表达量最高,达到4.54 mg/mL,占总的目的蛋白相对含量的60.3%。可溶性AiiA蛋白的高效表达为后续研究,如进行酶动力学的相关研究奠定基础。重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA培养诱导之后,破壁收集表达的可溶性AiiA蛋白,纯化后对其进行酶学特性的研究。研究表明该酶催化反应的最适温度为28℃,反应最适pH为6.5；AiiA蛋白酶对温度比较敏感,在28℃下保温30min酶活力还保持在81.8%左右,但是当在37℃下保温30min后急剧下降到19.1%,当在45℃下保温30min之后酶活基本丧失；AiiA蛋白酶在4℃冰箱储存24h后剩余酶活还维持在85%以上。当储存96h剩余酶活大概为20%,当储存120h后基本丧失酶活；以AHL底物浓度(S)分别为0.4mmol/L、0.6 mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L时测定AiiA在pH值为6.5、28℃下酶促反应的初速度(V0),以1/[S]对1/V0做Lineweaver-Burk图,拟合直线,得出AiiA酶水解AHL的Km和Vmax分别为：1.25mmol/L和25umol/L/min。对AiiA蛋白的酶学特性进行研究,不仅可以为进一步研究该酶的结构与功能、比较不同来源生物的酶学差异提供有益的数据,而且为今后探索AiiA蛋白的作用机理奠定理论基础,为改造AiiA蛋白的结构特性提供了理论依据。AiiA蛋白最适作用温度及其热稳定性直接影响其在实践中的应用范围。为了能够将AiiA蛋白应用范围扩大并最终实现产业化生产应用,有必要对AiiA蛋白结构进行改造,提高其热稳定性,使其更能适应外界自然环境并发挥作用。对AiiA蛋白的第57位、62位、65位、195位、206位氨基酸进行定点突变。第57位氨基酸由原来的Ala突变成Pro；第62位的氨基酸由原来的Gly突变为Ala；第65位氨基酸由原来的Asn突变为Lys；第195位氨基酸由原来的Thr突变为Asp；第206位氨基酸由原来的Ala突变为Glu。突变结果表明,AiiA-65-12、AiiA-195-12及AiiA-206-6酶活力均有一定程度的提高,其中AiiA-206-6最适作用温度为37℃,同野生型的28℃相比,最适反应温度提高了9℃,AiiA-206-6最适作用温度提高,可能是由于带负电强的极性氨基酸Glu增强了AiiA蛋白与Zn2+的结合力,提高了酶活力中心的稳定性；AiiA-65-12在37℃下保温30min酶活力还保持90%左右,相对于野生型AiiA蛋白酶的19.1%有了显著的提高；AiiA-195-12在4℃储存过程中酶活降低的速度比较均匀,没有出现急剧的下降过程,说明酶的稳定性有了一定的提高。AiiA-65-12及AiiA-195-12突变株不管是温度稳定性还是4℃储存稳定性都比野生AiiA蛋白有了比较明显的提高。本研究还选用了真核表达载体pPIC9K,构建了重组质粒pPIC9K-aiiA。获得GS115-pPIC9K-aiiA工程菌并初步鉴定其表达了AiiA蛋白。

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-9
目录  9-16
绪论  16-28
  1 信号分子的合成  16-19
    1.1 AHL的合成  16-17
    1.2 AIP的合成  17-18
    1.3 AI-2的合成  18-19
  2 几种革兰氏阴性细菌的群体感应机制  19-24
    2.1 费氏弧菌(Vibrio fischeri)的群体感应  19-20
    2.2 铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的群体感应  20-21
    2.3 胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的群体感应  21-22
    2.4 土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的群体感应  22-24
  3 细菌群体感应的应用  24-25
    3.1 抑制信号分子的合成  24
    3.2 降解信号分子  24
    3.3 抑制信号分子与受体蛋白的结合  24-25
  4 本课题的研究目的及意义  25-28
第一章 重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化  28-38
  第一节 前言  28
  第二节 材料和方法  28-30
    2.1 实验材料  28-29
      2.1.1 菌种  28
      2.1.2 主要试剂  28
      2.1.3 仪器与设备  28-29
    2.2 实验方法  29-30
      2.2.1 单菌落制备  29
      2.2.2 一级菌种制备  29
      2.2.3 破壁方法  29
      2.2.4 SDS-PAGE样品处理  29
      2.2.5 检测方法  29
        2.2.5.1 细胞密度的测定  29
        2.2.5.2 蛋白质相对含量测定  29
        2.2.5.3 生长曲线的测定  29
      2.2.6 培养基的筛选  29-30
      2.2.7 IPTG的优化  30
      2.2.8 初始生物量的优化  30
      2.2.9 诱导时间的优化  30
      2.2.10 装液量的优化  30
      2.2.11 pH的优化  30
      2.2.12 微量元素的优化  30
  第三节 结果与分析  30-35
    3.1 培养基的筛选  30-31
    3.2 IPTG浓度对AiiA蛋白可溶性表达的影响  31
    3.3 初始生物量对AiiA蛋白可溶性表达的影响  31-32
    3.4 诱导时间对AiiA蛋白可溶性表达的影响  32
    3.5 装液量对AiiA蛋白可溶性表达的影响  32-33
    3.6 pH对AiiA蛋白可溶性表达的影响  33
    3.7 微量元素对AiiA蛋白可溶性表达的影响  33-34
    3.8 工程菌生长曲线  34
    3.9 优化前后的比较  34-35
  第四节 小结与讨论  35-38
第二章 AiiA酶动力学分析  38-50
  第一节 前言  38
  第二节 材料和方法  38-44
    2.1 材料和方法  38-40
      2.1.1 菌种  38
      2.1.2 主要试剂  38
      2.1.3 缓冲液  38-40
        2.1.3.1 胶再生及纯化溶液  38-39
        2.1.3.2 SDS-PAGE溶液  39
        2.1.3.3 蛋白质浓度测定溶液  39-40
        2.1.3.4 牛血清白蛋白(BSA)标准品  40
      2.1.4 仪器与设备  40
    2.2 实验方法  40-44
      2.2.1 单菌落制备  40
      2.2.2 一级菌种制备  40
      2.2.3 培养及诱导方法  40-41
      2.2.4 破壁方法  41
      2.2.5 蛋白质纯化  41
      2.2.6 镍柱的再生  41
      2.2.7 SDS-PAGE样品处理  41-42
      2.2.8 细胞密度的测定  42
      2.2.9 蛋白质浓度的测定:Bradford法检测蛋白质含量  42
      2.2.10 AiiA蛋白酶活力测定  42-43
      2.2.11 AiiA蛋白反应进程曲线的测定  43
      2.2.12 pH对AiiA酶活力的影响  43
      2.2.13 温度对AiiA酶活力的影响  43
      2.2.14 AiiA蛋白的热稳定性  43-44
      2.2.15 AiiA蛋白4℃储存稳定性  44
      2.2.16 AiiA酶动力学参数Km值的确定  44
  第三节 结果与分析  44-49
    3.1 AHL标准曲线  44
    3.2 蛋白质浓度标准曲线  44-45
    3.3 AiiA蛋白反应进程曲线  45
    3.4 反应温度对AiiA蛋白酶催化活力的影响  45-46
    3.5 反应pH对AiiA蛋白酶催化活力的影响  46
    3.6 AiiA蛋白对热的稳定性  46-47
    3.7 AiiA蛋白4℃储存稳定性  47
    3.8 底物AHL的浓度对AiiA蛋白反应初速度的影响  47-48
    3.9 AiiA蛋白酶促反应的米氏常数和最大反应速度  48-49
  第四节 小结与讨论  49-50
第三章 AiiA蛋白定点突变  50-74
  第一节 前言  50
  第二节 材料和方法  50-56
    2.1 材料  50-52
      2.1.1 菌株和质粒  50
      2.1.2 主要试剂  50-51
      2.1.3 培养基及缓冲液  51
      2.1.4 定点突变引物  51-52
      2.1.5 主要仪器  52
    2.2 方法  52-56
      2.2.1 质粒的提取  52-53
      2.2.2 定点突变引物设计原则  53
      2.2.3 定点突变PCR条件的摸索  53-54
      2.2.4 制备E.coli BL21(DE3)感受态  54
      2.2.5 热击转化  54
      2.2.6 用DpnI选择突变体方法  54-55
      2.2.7 突变菌株的诱导表达  55
      2.2.8 破壁方法及突变蛋白的纯化  55
      2.2.9 突变后蛋白酶活的测定  55-56
      2.2.10 突变后AiiA的热稳定性  56
      2.2.11 温度对突变后AiiA酶活力的影响  56
      2.2.12 4℃储存时间对突变后AiiA酶活力的影响  56
  第三节 结果与分析  56-72
    3.1 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA质粒的提取  56
    3.2 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的定点突变  56-57
    3.3 突变质粒的转化和菌落PCR验证  57
    3.4 突变质粒的质粒PCR验证  57-58
    3.5 突变质粒的质粒双酶切验证  58
    3.6 定点突变质粒的测序和分析  58-61
    3.7 突变菌株与野生菌株酶活力比较  61
    3.8 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-57-5定点突变  61-63
      3.8.1. AiiA-57-5突变点的选择  61-62
      3.8.2. AiiA-57-5最适作用温度的研究  62
      3.8.3. AiiA-57-5温度稳定性的研究  62-63
      3.8.4. AiiA-57-5 4℃储存稳定性的研究  63
    3.9 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-62-6定点突变  63-65
      3.9.1 AiiA-62-6突变点的选择  63-64
      3.9.2 AiiA-62-6最适作用温度的研究  64
      3.9.3. AiiA-62-6温度稳定性的研究  64-65
      3.9.4. AiiA-62-6 4℃储存稳定性的研究  65
    3.10 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-65-12定点突变  65-67
      3.10.1 AiiA-65-12突变点的选择  65-66
      3.10.2 AiiA-65-12最适作用温度的研究  66
      3.10.3 AiiA-65-12温度稳定性的研究  66-67
      3.10.4 AiiA-65-12 4℃储存稳定性的研究  67
    3.11 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-195-12定点突变  67-70
      3.11.1 AiiA-195-12突变位点的选择  67-68
      3.11.2 AiiA-195-12最适作用温度的研究  68-69
      3.11.3 AiiA-195-12温度稳定性的研究  69
      3.11.4 AiiA-195-12 4℃储存稳定性的研究  69-70
    3.12 E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA-206-6定点突变  70-72
      3.12.1 AiiA-206-6突变位点的选择  70-71
      3.12.2 AiiA-206-6最适作用温度的研究  71
      3.12.3 AiiA-206-6温度稳定性的研究  71-72
      3.12.4 AiiA-206-6 4℃储存稳定性的研究  72
  第四节 小结与讨论  72-74
第四章 工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的构建  74-88
  第一节 前言  74
  第二节 实验材料和方法  74-82
    2.1 实验材料  74-77
      2.1.1 菌种与质粒  75
      2.1.2 主要试剂  75-76
      2.1.3 仪器与设备  76-77
    2.2实验方法  77-82
      2.2.1 引物的设计  77
      2.2.2 质粒的提取  77
      2.2.3 目的基因的PCR体系  77-78
      2.2.4 DNA回收  78
      2.2.5 连接反应  78-79
      2.2.6 制备JM109感受态细胞  79
      2.2.7 热击转化  79
      2.2.8 双酶切体系  79
      2.2.9 酵母细胞GS115感受态的制备  79
      2.2.10 电转法转化酵母细胞  79-80
      2.2.11 酵母基因组DNA的提取  80
      2.2.12 工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的培养及诱导  80
      2.2.13 免疫原的制备  80
      2.2.14 鼠血清抗体的制备  80-81
      2.2.15 血清效价的评定  81
      2.2.16 免疫血清的鉴定(western blot)  81-82
  第三节 结果与分析  82-86
    3.1 目的基因aiiA的获得  82
    3.2 亚克隆质粒PMD-18T-aiiA的PCR验证  82-83
    3.3 亚克隆质粒PMD-18T-aiiA的双酶切验证  83
    3.4 重组表达载体pPIC 9K-aiiA的PCR验证  83-84
    3.5 重组表达载体pPIC 9K-aiiA的双酶切验证  84-85
    3.6 重组毕赤酵母工程菌的构建  85
    3.7 小鼠血清效价的评定  85
    3.8 免疫血清的鉴定(western blot)  85
    3.9 工程菌GS115-pPIC9K-aiiA的培养及诱导  85-86
  第四节 小结与讨论  86-88
结论  88-90
展望  90-92
参考文献  92-102
致谢  102-104
个人简历  104-105

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