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应用mRNA差异显示技术筛选猪前脂肪细胞分化相关的基因

作　者: 张平平
导　师: 刘艳芬；刘铀
学　校: 广东海洋大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 猪脂肪细胞细胞增殖细胞分化差异显示差异表达
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂肪组织的生长与脂肪细胞体积增大及前脂肪细胞分化成脂肪细胞有关。在前脂肪细胞分化过程中伴随着许多基因的特异性表达,细胞形态亦有相应的变化。猪是脂肪沉积能力很强的动物之一,脂肪在皮下组织和内脏器官的过度沉积是影响猪肉品质的重要因素。本研究采用mRNA差异显示技术筛选猪前脂肪细胞分化过程相关的差异表达基因,为进一步研究猪脂肪沉积代谢的调控机制提供科学依据。试验1、猪前脂肪细胞的分离与鉴定取3日龄健康仔猪颈部皮下脂肪组织,利用胶原酶消化法分离猪前脂肪细胞,进行原代培养,并采用MTT法、油红O染色、LPL活性测定来鉴定猪前脂肪细胞。结果显示,体外培养的猪前脂肪细胞在经历短暂的迟缓期后,进入对数生长期,直至第7天开始进入平台期,在培养第10天开始出现细胞调亡。细胞形态学观察发现,原代培养的猪前脂肪细胞从第3天开始充脂,细胞内脂肪滴被油红O染成红色,此后伴随细胞增殖和分化,充脂细胞逐渐增多,小脂滴不断汇聚形成大脂滴,细胞也由梭形逐渐变圆,体积增大。同时,LPL活性也呈现先上升后下降的变化趋势。上述结果证实猪前脂肪细胞已被成功分离。试验2、猪前脂肪细胞分化过程差异表达基因的筛选为进一步探讨猪前脂肪细胞分化过程中可能表达的调控基因,采用mRNA差异显示技术来筛选与其分化有关的差异表达基因。分别收集原代培养3天、5天、7天、10天的猪前脂肪细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA。通过RT-PCR和6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色后,回收差异条带,并用PCR扩增,扩增片段克隆至pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并将测序结果与Genbank中相关基因序列进行同源性比较。结果表明:(1)采用DDRT-PCR技术成功获得20条EST序列,Blast在线分析结果表明,其中A22、A23、A33、A43、A55、A73、B42、C44等8个ESTs序列与Genbank数据库已报告的基因具有高度的同源性;A21、A32、A45、B41等4个ESTs序列与Genbank数据库已报告的基因同源性较低,其功能尚不明确;A31、A53、A24、B31、B71、C21、C62、C81等8个基因ESTs序列为本研究首次发现。(2)A21、A23、A31、A32、A43、A53、B31、B71、C21、C62均表达于猪前脂肪细胞原代培养的第3天和第5天,可能与前脂肪细胞增殖有关;A22在前脂肪细胞培养的第3、5、7天表达,在第10天没有表达或者是表达量很低,推测A22的表达与前脂肪细胞增殖、分化的转换和调节有关;B41在培养第5、7天表达,可能与脂肪细胞的增殖有关;B42、C81在前脂肪细胞培养的第5、7、10天表达,可能与脂肪细胞的分化调节;A24、A33、A45、A73、C44均在猪前脂肪细胞原代培养的第7天和第10天表达,与脂肪细胞分化进程有关;A55与人的PURB基因同源性达到93%,尚不清楚A55是否参与脂肪细胞增殖或分化的调节。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
1 前言  13-22
  1.1 研究目的与意义  13
  1.2 动物前脂肪细胞研究进展  13-20
    1.2.1 前脂肪细胞的增殖与分化  14-15
    1.2.2 脂肪细胞分化调节因子  15-17
    1.2.3 前脂肪细胞分化过程的转录调控因子  17-19
    1.2.4 前脂肪细胞的应用前景  19-20
  1.3 差异表达基因  20-22
    1.3.1 差异表达基因筛选方法  20
    1.3.2 DDRT-PCR 技术  20-21
    1.3.3 差异表达基因与脂肪的相关研究  21-22
2 猪前脂肪细胞的分离培养与鉴定  22-31
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 实验动物  22
    2.1.2 细胞培养相关试剂  22
    2.1.3 主要试剂的配制  22-23
    2.1.4 主要仪器  23-24
  2.2 实验方法  24-25
    2.2.1 猪前脂肪细胞的分离培养  24
    2.2.2 MTT 法绘制猪前脂肪细胞的生长曲线  24
    2.2.3 猪前脂肪细胞的形态学观察  24
    2.2.4 脂蛋白脂酶（LPL）活性测定  24-25
  2.3 结果  25-28
    2.3.1 猪前脂肪细胞的生长曲线绘制  25
    2.3.2 猪前脂肪细胞形态学观察  25-27
    2.3.3 成熟脂肪细胞的油红O 染色鉴定  27
    2.3.4 脂蛋白脂酶活性测定  27-28
  2.4 讨论  28-30
    2.4.1 关于猪前脂肪细胞培养  28-29
    2.4.2 关于脂肪细胞的鉴定  29-30
    2.4.3 猪前脂肪细胞增殖与分化的规律  30
  2.5 小结  30-31
3 猪前脂肪细胞分化相关基因的筛选  31-58
  3.1 材料  31-33
    3.1.1 菌种与载体  31-32
    3.1.2 酶类及其他试剂  32
    3.1.3 主要试剂的配制  32-33
    3.1.4 引物合成  33
    3.1.5 主要仪器  33
  3.2 实验方法  33-39
    3.2.1 细胞总RNA 提取与检测  33-34
    3.2.2 RT-PCR  34-35
    3.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染  35-36
    3.2.4 差异片段的PAGE 回收与PCR 再扩增  36-37
    3.2.5 差异片段的琼脂糖纯化与回收  37
    3.2.6 差异片段的克隆筛选  37-38
    3.2.7 差异片段的测序及其同源性分析  38-39
  3.3 结果  39-51
    3.3.1 mRNA 质量检测  39
    3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果  39-43
    3.3.3. 差异片段的纯化回收  43-44
    3.3.4 重组菌的PCR 鉴定  44
    3.3.5 差异片段的测序结果及其同源性分析  44-51
  3.4 讨论  51-56
    3.4.1 细胞总RNA 提取  51
    3.4.2 DDRT-PCR  51-52
    3.4.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与差异条带回收  52-53
    3.4.4 差异片段的再扩增与琼脂糖回收  53-54
    3.4.5 关于DDRT-PCR 的假阳性  54
    3.4.6 差异基因EST 序列同源性分析  54-56
  3.5 小结  56-58
4 结论  58-59
参考文献  59-67
致谢  67-68
作者简介  68-69
导师简介  69-70

应用mRNA差异显示技术筛选猪前脂肪细胞分化相关的基因

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