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罗非鱼病原菌分离鉴定及不同品系间抗病力初步比较

作　者: 柯剑
导　师: 姜兰；赵飞
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 罗非鱼无乳链球菌盐度抗病力免疫球蛋白
分类号: S965.125
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

罗非鱼是联合国粮食和农业组织推荐的养殖品种;中国是世界上最大的罗非鱼养殖国之一,近年来年产量均在120万吨以上,约占世界总产量的50%,罗非鱼已经形成产业链发展模式。目前,我国有11个具有稳定遗传性状的纯系及杂交养殖品种,其中以吉富和奥尼品种的养殖最为广泛。随着罗非鱼养殖规模的不断扩大,2007年以来罗非鱼大规模暴发病逐渐盛行。调查表明:不同养殖规格、不同养殖阶段的罗非鱼发病状况各有不同。病原主要为细菌,包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、无乳链球菌以及海豚链球菌。2010年4月⁶月,广东省罗非鱼鱼苗（体长6¹4cm）大规模暴发性出血病,从发病罗非鱼分离到多种病原菌,其中优势病原鉴定为温和气单胞菌。通过对近年来广东、海南大规模罗非鱼暴发病病原进行分析,2009年和2010年连续两年的7月¹0月前后,导致广东、海南两省成鱼发生大规模暴发病的病原为无乳链球菌。药物敏感性试验显示,无乳链球菌各地分离株之间存在差异。罗非鱼常见病原菌温和气单胞菌、无乳链球菌、嗜水气单胞菌及最小弧菌的药敏实验结果显示:对氯霉素和诺氟沙星都敏感。氯霉素为渔用禁药,其替代物氟苯尼考对无乳链球菌的最小抑菌浓度为1.69mg mL^-1。链球菌是近两年危害罗非鱼成鱼的头号病原,氟苯尼考为畜牧水产允许使用的药物,可作为罗非鱼细菌性病害防治的首选药物之一。为了研究渗透压和盐度对病原菌增殖的影响,将罗非鱼常见病原接种于NaCl梯度为0.05%,0.55%,1.05%,1.55%,2.05%,2.55%,3.05%,3.55%,4.05%,4.55%的脑心浸液（BHI）培养基,接种浓度为2.0Mcf菌悬浮液,培养15⁴8h后,用麦氏比浊法测定菌浓度,NaCl浓度由0.05%增加到0.55%,无乳链球菌、海豚链球菌、温和气单胞菌及爱德华氏菌的增殖量显著降低,嗜水气单胞菌增殖无明显变化。NaCl浓度≥1.05%时,海豚链球菌基本不增殖。NaCl浓度在0.55%¹.55%范围内,NaCl浓度增加,无乳链球菌、温和气单胞菌及爱德华氏菌的增殖量都显著降低（P<0.05）。NaCl浓度在1.55%².05%范围内,温和气单胞菌和爱德华氏菌增殖量显著下降,无乳链球菌和嗜水气单胞菌增殖量无明显变化。NaCl浓度在2.05%².55%范围内,无乳链球菌、温和气单胞菌和嗜水气单胞菌增殖随盐度增加显著降低,爱德华氏菌无显著变化。NaCl浓度在2.55%³.05%范围内,无乳链球菌和温和气单胞菌增殖量随盐度增加显著降低,嗜水气单胞菌和爱德华氏菌增殖量无显著变化。环境因素对病原菌的增殖有一定的影响。环境因子的变化,可能对养殖水体微生物生态构成造成显著的影响。咸水养殖还可以改善鱼类肉质和口味,发展咸水养殖罗非鱼对降低当前病害对罗非鱼养殖造成的风险可能有一定的应用意义。早期研究表明,水产动物对暴发疾病的抵抗能力存在物种间差异。用嗜水气单胞菌浸泡感染体长为7⁸cm,9.0⁹.5cm,11.5¹2.5cm阶段的奥利亚、尼罗、奥尼、吉富、莫荷五个品系罗非鱼,样本量为50⁸0尾/组,采取少量多次试验的方式,每箱每个品系罗非鱼5¹0尾。密度为25⁴0尾/池,养殖环境为室内1m 0.5m的水族箱、水深0.5m,水温23²8℃,持续曝气,菌感染浓度为2.7 10⁷ cfu mL^-1¹.2108cfu mL^-1,记录累计死亡率。分别测定规格为11.5¹2.5cm的五个品系罗非鱼在微流水养殖条件下的血清溶菌酶、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、一氧化氮酶、过氧化物酶等非特异性免疫指标,同时测定嗜水汽单胞菌浸泡感染后5日和10日存活实验鱼的血清溶菌酶、碱性磷酸酶含量。结果显示:连续观察10日,体长为5.0⁷.0cm规格的实验鱼累计死亡率分别为莫荷罗非鱼（O.mossambica O.hornorum） 53.33%、奥尼罗非鱼（ O.aureus O.niloticus）63.33%、吉富罗非鱼（O.niloticus,GIFT strain）86.67%;连续观察6日,体长为9.0⁹.5cm规格的实验鱼累积死亡率分别为尼罗的52.0%、奥尼62.2%、莫荷68.0%、奥利亚70.0%、吉富78.0%;连续观察6日,体长为11.5¹2.5cm规格的实验鱼累积死亡率分别为奥利亚26.3%、奥尼32.5%、吉富37.5%、莫荷60.0%。11.5¹2.5cm规格的莫荷罗非鱼和奥利亚罗非鱼在嗜水气单胞菌浸泡感染5d和10d后溶菌酶含量呈上升趋势,而碱性磷酸酶（AKP）含量维持不变。无乳链球菌注射感染体长为8.5¹0.0cm规格的五个品系罗非鱼,连续观察10日,累计死亡率分别为尼罗罗非鱼46.7%、奥利亚罗非鱼60.0%、莫荷罗非鱼66.7%、奥尼罗非鱼93.3%、吉富罗非鱼93.3%。综合分析以上数据,奥尼罗非鱼整体上存活率相对较高,奥尼罗非鱼可能是实际生产中生长速度和抗病力都比较均衡的品种。为后续建立单克隆抗体检测方法及罗非鱼免疫相关研究,采用一种简易快速的A蛋白亲和层析法,从个五品系育成期罗非鱼（30⁵0g）血液中分离纯化免疫球蛋白。结合缓冲液为pH7.4的PBS,结合温度4℃,洗脱缓冲液为pH3.0的柠檬酸溶液,流速1.3mL min-1,进样1ml血清分离得到IgM浓度在1.86 mg·ml-1².95 mg·ml-1之间,通过变性SDS-PAGE检测,均得到大小80kD和30kD左右两条清晰条带,认为是五种罗非鱼免疫球蛋白的重链和轻链。A蛋白亲和层析法方便快速,得到Ig浓度和纯度高,技术稳定可靠,可作为实验室小量快速分离纯化罗非鱼血清Ig的理想方法。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-11
第一部分研究背景  11-18
  1.1 我国罗非鱼养殖概况  11-12
  1.2 杂交优势与抗病力利用  12-13
  1.3 罗非鱼细菌性病害  13-15
    1.3.1 病害的命名及病原的分离纯化  13
    1.3.2 罗非鱼常见的病原菌  13-15
  1.4 罗非鱼细菌性病害的流行规律  15-16
  1.5 罗非鱼细菌性病害发生的相关因子  16
  1.6 本文研究思路  16-18
第二部分研究内容  18-49
  第一章罗非鱼病原菌的分离鉴定  18-35
    1.1 材料与方法  18-20
      1.1.1 试验用鱼  18
      1.1.2 病原菌的分离纯化  18
      1.1.3 人工感染试验  18-19
      1.1.4 生理生化鉴定及培养特性  19
      1.1.5 16SrRNA 基因扩增及序列分析  19
      1.1.6 药敏试验  19
      1.1.7 氟苯尼考抑菌实验  19-20
      1.1.8 盐度对几种罗非鱼病原菌增殖的影响  20
    1.2 结果  20-31
      1.2.1 人工感染试验  20-21
      1.2.2 菌株形态和生理生化试验  21-24
      1.2.3 分离菌株 16SrRNA 基因序列分析  24-26
      1.2.4 药敏试验  26-27
      1.2.5 氟苯尼考原粉的抑菌效果  27-28
      1.2.6 盐度对罗非鱼病原菌增殖的影响  28-31
    1.3 讨论  31-34
    1.4 小结  34-35
  第二章罗非鱼品系间抗病力的初步比较  35-43
    2.1 材料与方法  35-37
      2.1.1 实验用鱼  35-36
      2.1.1 人工感染试验  36
      2.1.3 血液非特异性免疫指标的测定  36-37
    2.2 结果  37-41
      2.2.1 人工感染存活率  37-39
      2.2.2 血液非特异性免疫指标测定  39-41
    2.3 小结与讨论  41-43
  第三章 A 蛋白亲和层析柱分离纯化罗非鱼免疫球蛋白  43-49
    3.1 材料方法  43-44
      3.1.1 实验鱼  43
      3.1.2 仪器与试剂  43-44
      3.1.3 免疫球蛋白分离纯化步骤  44
      3.1.4 绘制标准曲线和洗脱曲线  44
      3.1.5 变性条件下的 SDS-PAGE 检测分子量  44
    3.2 结果  44-48
    3.3 讨论  48-49
全文总结  49-50
参考文献  50-54
攻读硕士学位期间完成的论文  54-55
致谢  55

罗非鱼病原菌分离鉴定及不同品系间抗病力初步比较

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