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无机三氧化聚合物调控根尖牙乳头干细胞分化的机制研究

作　者: 闫明
导　师: 于金华; 张光东
学　校: 南京医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 无机三氧化聚合物根尖牙乳头干细胞分化 NF-κB通路
分类号: R783.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

生物活性材料无机三氧化聚合物（mineral trioxide aggregate, MTA）现已广泛应用于根尖诱导成形术的临床治疗，并取得了较好的效果，但其对牙根发育及再生过程中的重要种子细胞——根尖牙乳头干细胞（stem cells from apicalpapilla, SCAPs）增殖分化能力的影响，以及其中的作用机制尚不清楚。本文将分三个部分就这一问题进行探讨分析：第一部分MTA条件培养基的制备和诱导浓度筛选研究目的：制备MTA条件培养基，筛选最佳诱导浓度，观察其对SCAPs增殖能力的影响。研究方法：制备MTA条件培养基，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性检测实验筛选诱导SCAPs矿化的最佳浓度，通过茜素红染色实验及10%氯代十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride, CPC）溶液溶解钙离子定量实验佐证。另外，采用四甲基偶氮噻唑盐（methyl-thiazolyl-tetrazolium, MTT）法绘制SCAPs生长曲线，计算细胞群体倍增时间（population doubling time, PDT），以及流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞周期分布，计算细胞的增殖指数（proliferation index, PI），检测MTA条件培养基对SCAPs的增殖能力的影响。实验结果： ALP活性检测结果显示，MTA条件培养基诱导3d时，2mg/mL组的SCAPs细胞ALP活性最高（P <0.01）。采用该浓度MTA诱导14d时，茜素红染色结果显示，诱导组矿化结节形成能力明显高于未诱导组（P <0.01）。PDT和细胞周期分析后的PI结果均显示，两组SCAPs的增殖能力无明显差异（P>0.05）。结论：2mg/mL MTA不影响SCAP细胞的增殖能力，但对SCAPs的矿化能力有明显的促进作用。第二部分MTA对SCAPs分化以及形态发生能力的影响研究目的：进一步明确MTA对SCAPs牙向/骨向分化以及形态发生能力的影响。研究方法：提取MTA诱导3d和7d时的细胞总RNA和总蛋白，通过实时定量逆转录聚合酶链式反应实验（real-time reverse transcription polymerase chainreaction, real-time RT-PCR）检测牙向/骨向分化相关标志基因（ALP, DSPP,RUNX2, OCN等）的表达情况，蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测牙向/骨向分化相关标志蛋白（DSP, RUNX2, OCN等）的表达情况。另外，将细胞团复合根管支架材料，体内移植后，观测诱导后SCAPs的形态发生能力。实验结果：Real-time RT-PCR和Western blot结果显示，MTA诱导组OCN、RUNX2、DSP等基因/蛋白表达水平明显高于未诱导组，提示MTA可增强SCAPs的牙向/骨向分化能力。体内移植实验发现，与未诱导组相比，MTA诱导后的SCAPs可以形成类牙本质牙髓复合体结构，并且表达较高水平的DSP、RUNX2、OCN等矿化相关蛋白。结论：MTA明显促进SCAPs的牙/骨向分化、牙本质牙髓复合体形成能力。第三部分MTA调控SCAPs分化的NF-κB通路机制研究目的：探讨核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）通路在MTA诱导的SCAPs分化过程中的调控作用。研究方法：选取MTA条件培养基刺激0h、0.25h、0.5h、3h、6h和12h，分别提取各时间点的SCAPs胞浆蛋白和胞核蛋白，Western blot检测通路相关蛋白（NF-κB P65、IκB-α、磷酸化NF-κB P65、磷酸化IκB-α）的表达，检测NF-κB通路的激活情况。另外，制作细胞爬片，将上述六个时间点的SCAPs固定后，对NF-κB P65进行免疫荧光染色，观察P65的核转位情况，间接反映NF-κB通路的活性状态。实验结果：NF-κB通路关键蛋白的Western blot和荧光染色检测结果表明，P65核转位明显。表达结果显示：P65逐渐由胞浆转入核内；p-P65在0.25h表达已显著升高，并在0.5h时继续上升，但随后开始下降；IκB-α先略有下降，然后恢复；p-IκB-α在0.25h表达即到最高，0.5h时虽开始下降但仍为高表达。提示NF-κB通路被激活。NF-κB P65的荧光染色检测亦表明，P65转入细胞核内启动相关转录程序。结论：MTA诱导SCAPs的牙/骨向分化和形态发生，可能是通过激活NF-κB通路来实现的。

全文目录

英文缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-14
前言  14-17
第一部分 MTA 条件培养基的制备和诱导浓度筛选  17-27
  1 材料和方法  17-21
  2 结果  21-24
  3 讨论  24-26
  4 结论  26-27
第二部分 MTA 对 SCAPs 分化以及形态发生能力的影响  27-42
  1 材料和方法  27-34
  2 结果  34-40
  3 讨论  40-41
  4 结论  41-42
第三部分 MTA 调控 SCAPs 分化的 NF-κB 通路机制  42-51
  1 材料和方法  42-45
  2 结果  45-49
  3 讨论  49-50
  4 结论  50-51
全文总结  51-52
参考文献  52-58
文献综述  58-73
  参考文献  67-73
攻读学位期间发表文章及获奖情况  73-74
致谢  74

无机三氧化聚合物调控根尖牙乳头干细胞分化的机制研究

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