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NF-κB通路负调控Keap1-Nrf2通路及其分子机制研究

作　者: 李慧
导　师: 杨晓明
学　校: 天津大学
专　业: 制药工程
关键词: NF-κB通路 Nrf2通路 p65蛋白 Keap1蛋白 蛋白相互作用
分类号: Q257
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


NF-κB和Keap1-Nrf2是细胞内两条重要的信号通路,分别参与炎症调节及抗氧化基因表达调控。实验表明许多外界刺激在抑制NF-κB活性的同时都能活化Nrf2。这提示我们这两个发挥重要调控作用的信号通路之间可能存在着某种层次上的交互。以此为出发点,本研究探讨了NF-κB通路和Nrf2通路之间的交互关系。首先我们建立了针对两个转录因子活性研究的报告基因系统,并验证了其有效性。进而研究了TNF-α、IL-1β及PMA等外源刺激对NF-κB与Nrf2通路的影响,发现三种刺激都能活化NF-κB通路并轻微负调控Nrf2通路。进一步研究发现, NF-κB信号通路中不同水平的激活分子在活化NF-κB的同时,能够显著负调控Nrf2通路,而NF-κB的负调控蛋白IκBα能够抑制NF-κB信号通路并活化Nrf2通路。我们实验室前期的结果已表明活化与抑制Keap1-Nrf2通路对NF-κB通路几无影响,这些结果提示NF-κB通路的活化可负调控Nrf2通路。TNF-α、IL-1β及PMA在活化NF-κB通路时对Keap1-Nrf2通路的抑制明显弱于NF-κB通路中激活分子的作用,可能与TNF-α、IL-1β及PMA可活化多条NF-κB外信号通路相关,表明细胞内信号通路交互的复杂性。p65是NF-κB通路中最下游的蛋白质,研究发现p65对Nrf2的负调控作用最为显著且能够降低Nrf2的DNA结合活性,因此推论p65可能是NF-κB通路负调控Nrf2通路的功能执行蛋白。转录活性缺失的p65截短体仍具有负调控Nrf2的功能,说明这种负调控并不依赖于p65转录活性,可能是通过蛋白质相互作用来实现的。本实验室在前期研究中,通过酵母双杂交筛选发现p65与Nrf2的负调控蛋白Keap1存在相互作用。本论文采用免疫共沉淀、Pull Down等实验,验证了p65与Keap1之间的相互作用,为揭示NF-κB通路负调控Keap1-Nrf2通路的分子机制奠定基础。本论文研究发现细胞内NF-κB通路的活化能够负调控Nrf2通路,这种负调控可能是通过p65与Keap1之间的蛋白相互作用完成的。这为揭示两条通路之间的交互作用和分子机制提供了新的线索。同时也加深了我们对于两条通路在免疫反应和抗氧化应激反应中的生物学功能的认识。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
前言  8-9
第一章 文献综述  9-22
  1.1 引言  9
  1.2 Nrf2-Keap1-ARE 信号通路  9-16
    1.2.1 Nrf2 的基本结构与功能  10-11
    1.2.2 Keap1 基本结构与功能  11-12
    1.2.3 Nrf2-Keap1-ARE 信号通路激活机制  12-15
    1.2.4 Nrf2-Keap1-ARE 信号通路的生物学功能  15-16
  1.3 NF-κB 信号通路  16-20
    1.3.1 NF-κB/ IκB/IKK 组成结构及功能  16-17
    1.3.2 NF-κB 信号通路的激活  17-20
    1.3.3 NF-κB 生物学功能  20
  1.4 NF-κB 通路与Nrf2 通路的交互  20-22
第二章 材料与方法  22-33
  2.1 仪器设备  22-23
  2.2 溶液配制  23-25
    2.2.1 细菌培养相关溶液  23
    2.2.2 细胞培养相关溶液  23
    2.2.3 Western-Blot 相关试剂  23-24
    2.2.4 细胞裂解溶液  24
    2.2.5 核蛋白提取相关溶液  24
    2.2.6 凝胶迁移实验相关溶液  24-25
  2.3 实验材料  25-26
    2.3.1 质粒  25
    2.3.2 菌株  25
    2.3.3 细胞  25
    2.3.4 试剂  25-26
  2.4 实验方法  26-33
    2.4.1 细胞培养条件  26
    2.4.2 细胞总蛋白质的提取  26
    2.4.3 质粒DNA 的小量提取  26-27
    2.4.4 细胞转染  27
    2.4.5 免疫印迹Western Blot  27-28
    2.4.6 细胞总RNA 的提取  28
    2.4.7 反转录PCR  28-29
    2.4.8 重组质粒载体的构建  29
    2.4.9 双荧光素酶报告基因检测  29-30
    2.4.10 凝胶迁移实验  30-32
    2.4.11 免疫共沉淀  32
    2.4.12 Pull Down  32-33
第三章 实验结果  33-60
  3.1 双荧光素酶报告基因检测系统的建立  33-37
    3.1.1 报告基因在HEK293 细胞系和HepG2 细胞系中的活性  33-35
    3.1.2 HEK293 细胞中pGL3-ARE 剂量与活性关系  35-36
    3.1.3 Keap1 对pGL3-ARE 的影响  36-37
  3.2 外源刺激活化NF-κB 通路对Nrf2 通路的调控  37-43
    3.2.1 HEK293 细胞中外源刺激对NF-κB 通路及Nrf2 通路的影响  38-40
    3.2.2 HepG2 细胞中外源刺激对NF-κB 通路和Nrf2 通路的影响  40-43
  3.3 NF-κB 通路蛋白对于Nrf2 通路的调控  43-53
    3.3.1 NF-κB 通路激活蛋白对Nrf2 通路的调控  44-50
    3.3.2 IκBα对Nrf2 通路的调控  50-51
    3.3.3 p65 对Nrf2 通路的调控  51-53
  3.4 p65 对Nrf2 的DNA 结合活性的影响  53-55
  3.5 p65 截短体对Nrf2 的调控  55-57
  3.6 p65 与Keap1 相互作用验证  57-60
第四章 讨论  60-66
  4.1 双荧光素酶报告基因检测系统有效性  60
  4.2 NF-κB 通路负调控Nrf2 通路  60-63
  4.3 p65 负调控Nrf2 通路的分子机制  63-64
  4.4 NF-κB 通路负调控Nrf2 通路意义  64-66
第五章 结论与展望  66-67
  5.1 结论  66
  5.2 展望  66-67
参考文献  67-71
致谢  71

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生理学 > 细胞内的信息传递
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