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Wnt/β-catenin信号通路对炎症状态下牙周膜干细胞成骨分化的调控机制研究

作　者: 孔祥伟
导　师: 丁寅; 金岩
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 牙周膜干细胞炎症 GSK3β 成骨分化 β-catenin
分类号: R781.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

牙周炎是一类以牙龈炎症和牙槽骨吸收为主要特征的慢性炎症性疾病。现有的治疗方法如牙周刮治，甚至引导组织再生术等，均不能获得牙周组织的完全再生。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）的发现为牙周炎的治疗提供了新的思路和方法。近年来已有许多研究报导，PDLSCs复合组织工程支架材料可在体内形成牙骨质/牙周膜样结构。牙周炎患者的牙周组织再生是受到抑制的，然而关于炎症状态下PDLSCs的生物学行为和牙周组织再生能力的改变却鲜有报道，其具体分子机制尚不清楚。干细胞内部有许多错综复杂的信号通路调控着干细胞的命运和数目，其中Wnt信号通路在骨的形成和改建过程中发挥了重要作用。我们前期的研究也发现在炎症牙周组织来源的PDLSCs中检测到了高表达的β-catenin，提示Wnt/β-catenin信号通路可能与炎症状态下PDLSCs的成骨分化有关。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK3β）是Wnt经典通路中非常重要的负性调控因子，参与了包括炎症在内的多种疾病的发生、发展。基于这些研究，我们提出假设：炎症微环境可造成PDLSCs中GSK3β的功能发生改变，继而引发下游Wnt/β-catenin信号通路的激活和成骨分化能力的下降。实验分为两个部分：1.炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞生物学行为的观察。目的：通过比较正常及炎症组织来源的PDLSCs（H-PDLSCs和P-PDLSCs）增殖和分化能力，探讨炎症微环境对PDLSCs生物学行为的影响。方法：1）从正常及炎症感染的牙周组织中分离、培养PDLSCs，并采用有限稀释法进行克隆纯化。2）流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记。3）通过MTT细胞生长曲线、克隆形成率，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，比较两种PDLSCs的增殖能力。4）将正常及炎症PDLSCs分别进行成骨、成脂诱导。通过茜素红染色、ALP染色及ALP活性、实时定量PCR检测成骨相关基因Runx2、ALP、BSP、OCN mRNA的表达，比较两种PDLSCs的成骨分化能力；通过油红O染色，比较两种PDLSCs的成脂分化能力。5）脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激H-PDLSCs、P-PDLSCs和单核细胞，24h收集培养上清，ELISA检测炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。结果：1）在炎症感染的牙周组织中同样含有牙周膜干细胞，两种PDLSCs都呈成纤维细胞样的纺锤形，具有克隆形成能力，且细胞表面分子的表达基本一致。2）MTT细胞生长曲线、克隆形成率和流式细胞周期检测结果均表明，P-PDLSCs的增殖能力要高于H-PDLSCs；细胞凋亡检测结果显示，两种PDLSCs的凋亡情况没有显著差别，但P-PDLSCs在成骨诱导之后凋亡明显增加。3）茜素红染色及定量、ALP染色及ALP活性、实时定量PCR结果说明P-PDLSCs的成骨分化能力要明显低于H-PDLSCs；油红O染色P-PDLSCs的脂滴形成量要明显少于H-PDLSCs，说明P-PDLSCs的成脂分化能力也受到了抑制。4）在LPS刺激下单核细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，其中TNF-α的上调最为显著，但H-PDLSCs和P-PDLSCs均不会分泌炎性因子；使用TNF-α刺激H-PDLSCs可明显抑制其成骨分化。结论：1）在炎症微环境的作用下，PDLSCs的增殖能力提高，而成骨、成脂分化能力下降。2）在炎症微环境中，TNF-α是抑制PDLSCs成骨分化的关键因子之一。2.炎症状态下牙周膜干细胞成骨能力下降的机制研究。目的：研究炎症微环境抑制牙周膜干细胞成骨分化的分子机制。方法：1）成骨诱导后， Western blot检测Wnt经典信号通路相关蛋白GSK3β/p-GSK3β、β-catenin在H-PDLSCs和P-PDLSCs中的表达。2）使用TNF-α刺激H-PDLSCs，Western blot检测GSK3β/p-GSK3β、β-catenin的蛋白表达情况。3）双荧光素酶报告系统检测β-catenin/TCF转录活性。以TOPFlash为报告质粒， FOPFlash为阴性对照，共转染pRL-TK作为内参对照；用Lipofectamine2000转染。4）在成骨诱导时使用LiCl或Wnt3a处理H-PDLSCs，茜素红染色和ALP染色观察PDLSCs成骨分化的情况。5）siRNA转染下调β-catenin，成骨诱导时加入TNF-α，7d后ALP染色观察PDLSCs成骨能力的变化。结果：1）Western blot结果显示P-PDLSCs中p-GSK3β和β-catenin的蛋白表达水平较H-PDLSCs增多，GSK3β总蛋白表达水平未见明显变化。成骨诱导后，两种PDLSCs中p-GSK3β和β-catenin的表达均有所减弱。TOPFlash/FOPFlash荧光素酶检测，TNF-α处理组β-catenin/TCF的转录活性要明显高于对照组。说明，Wnt/β-catenin信号通路在炎症状态下PDLSCs的成骨分化过程中起着负向调控的作用，并与GSK3β的活性抑制有关。2）p-GSK3β的表达随TNF-α的刺激呈现出时间和剂量依赖性的增加；同时，在TNF-α的刺激下，无论是在细胞全蛋白还是核蛋白中，β-catenin的蛋白表达水平均随着刺激浓度和时间的增加而增加。3）在使用LiCl抑制GSK3β活性或Wnt3a激活Wnt/β-catenin信号通路后，PDLSCs的成骨分化受到抑制，这与TNF-α对PDLSCs成骨分化的作用相同。4）使用小分子RNA干扰技术下调β-catenin后，ALP染色结果显示，在TNF-α刺激下，siβ-catenin组的成骨分化并未受到明显影响，而空载体组PDLSCs的成骨分化受到抑制。结论：在慢性炎症微环境中，TNF-α通过磷酸化GSK3β，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制牙周膜干细胞的成骨分化。

Wnt/β-catenin信号通路对炎症状态下牙周膜干细胞成骨分化的调控机制研究

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