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ClC-7参与氟斑牙和氟骨症发生的实验动物研究

作　者: 郑冬冬
导　师: 段小红; 毛天球
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔医学
关键词: 氟中毒氟斑牙氟骨症氯离子通道 ClC-7
分类号: R781.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

地方性氟中毒(endemic fluorosis)在牙齿与骨骼表现出一定症状，分别命名为氟斑牙和氟骨症。当人群长期处于高氟环境中，呼吸高氟污染空气，摄入含高氟的食物或水可造成全身慢性蓄积性氟中毒。本课题组通过前期的体外实验对于氟离子进出细胞的途径以及发病的机制有了初步的了解，对陕西省高氟地区的氟中毒病人的调查以及其氯离子通道分子生物学研究发现不同个体和遗传背景因素对氟存在敏感性方面的差异。在以上研究的基础上，通过建立氟中毒动物模型，通过体内实验研究氟中毒发病机制与氯离子通道的关系进一步对氟中毒机制进行新的诠释。本实验通过建立饮水型氟中毒小鼠的动物模型，待到一定时期观察其牙齿以及骨形态的变化，以确定模型的建立。而后对其组织取材研究电压门控氯离子通道-7（voltage-gated chloride channel-7，ClC-7）生物学特性的变化进行检测，最后将所得结果进行统计、分析以及比较。相关研究内容如下：第一部分：选取SPF级C57BL/6J小鼠作为实验动物，实验组饮用水加入100mg/L氟化钠刺激，观察小鼠的体型、体重及切牙形态等一般状况，根据《小鼠氟斑牙分级标准》以确定小鼠饮水型氟中毒模型的建立成功与否。对小鼠切牙进行HE染色明确高氟对成釉细胞的形态功能造成的损害。第二部分：对实验小鼠股骨远端骭骺端近中0.5mm处，约1mm长的股骨内腔区域进行CT扫描三维重建其骨小梁形态及骨微参数动态观察分析以明确高氟对小鼠骨结构的损害；对骨组织取材进行HE染色，观察其结构形态的变化。第三部分：对氟中毒小鼠的骨组织以及牙组织取材，提取总mRNA，通过反转录以及实时定量PCR技术和免疫组织化学技术对各组Clcn7mRNA相对表达水平及ClC-7蛋白表达水平的变化进行检测，以确定ClC-7是否参与了氟中毒的发生。第四部分：为进一步明确高氟亲代的子代小鼠是否会受到高氟刺激而引起其牙组织的形态学及ClC-7相关生物学特性的改变，我们对高氟亲代的新生P1小鼠的牙胚通过实时定量PCR技术对Clcn7mRNA相对表达水平进行了检测，并通过HE染色观察牙胚的形态学改变。主要研究结果如下：1.实验组小鼠在高氟刺激2个月时出现了重度氟斑牙，氟斑牙指数达到9级；染氟2个月及6个月时实验组小鼠出现脊柱弯曲，精神萎靡，食欲不振，行动不便等症状。体重较对照组显著减轻（p<0.05）。通过HE染色观察到实验组小鼠分泌期成釉细胞核极化明显，成釉细胞近釉基质侧的胞浆中有空泡、大小不均的黑色颗粒出现，部分区域则在细胞下形成囊泡，釉基质分泌不均匀。以上状况表明实验组小鼠出现了氟中毒症状，证明该氟中毒模型的氟斑牙模型建立成功。2. Micro-CT动态观察发现：氟中毒小鼠的骨质特征为骨密度降低，骨量丢失，骨小梁结构改变，骨强度下降；TRAP和HE染色发现实验组小鼠处于高速骨转化状态，呈现活动性骨质疏松。以上结果表明已成功复制骨质疏松型氟骨症小鼠模型，为以后的实验研究提供了基础。3.Real-time PCR检测发现：实验组小鼠切牙Clcn7mRNA的相对表达水平在实验2个月时较对照组下降49.7%（p<0.05），6个月时表达水平无显著性差异（p>0.05）；实验组小鼠股骨Clcn7mRNA的相对表达水平在实验2个月时较对照组上升5.5倍（p<0.01），实验6个月时表达水平无显著性差异（p>0.05）；IHC染色发现：对照组小鼠切牙IHC染色可见ClC-7蛋白高表达于各期成釉细胞，增殖分化期与分泌期成釉细胞交界处和分泌期成釉细胞分泌釉基质端有强表达；实验组分泌期成釉细胞的排列无序，伴有细胞凋亡所留下的空泡轮廓，ClC-7蛋白高表达于呈团块状增殖转化期成釉细胞。小鼠股骨IHC染色可见实验组小鼠股骨干骺板大量堆积的钙化软骨细胞且高表达ClC-7。以上结果表明，ClC-7生物学活性的改变与氟斑牙的发生存在某些联系；氟中毒造成骨改建加速，破骨与成骨并存，一方面破骨细胞数量增多，酸性物质分泌活跃，ClC-7可调节破骨细胞的酸碱平衡，是与骨吸收密切相关的重要通道，其生物学活性增强；另一方面，大量出现的钙化软骨细胞受高氟刺激高表达ClC-7，因此ClC-7可作为检测氟骨症发生的一项生物学指标。4.2个月实验组小鼠子代牙胚Clcn7mRNA相对表达水平较对照组子代下降72%（p<0.05）；6个月实验组小鼠子代牙胚Clcn7mRNA相对表达水平较对照组子代下降63%（p<0.05）。2个月实验组小鼠子代牙胚Clcn7mRNA相对表达水平与6个月实验组子代比较表达无显著性差异（p>0.05）。HE染色结果发现实验组亲代所产子代小鼠钟状晚期磨牙胚成釉细胞与釉质相分离，牙尖发育异型性明显，2个月实验组子代磨牙胚的牙尖扭曲，异型性更明显；实验组子代切牙胚成釉细胞排列不规则，稀疏，其分泌产生的釉质较厚，但釉质形态较对照组粗糙，欠光滑。成釉细胞与釉质相分离。以上结果表明亲代处于高氟环境，子代牙齿发育亦会受到高氟影响，其ClC-7相关生物学特性的改变可能也是由高氟所引起。综以上结果表明，氟中毒小鼠及其子代牙和骨的相关生物学特性均发生了改变，高氟刺激不仅改变了亲代小鼠牙齿及股骨的组织学形态，并会对其子代的牙齿发育造成不利的影响；ClC-7可作为检测氟中毒发生的一项生物学指标，ClC-7可能参与了氟中毒的发病机制。

ClC-7参与氟斑牙和氟骨症发生的实验动物研究

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