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高氟对成釉细胞生物学特性影响的体外研究

作　者: 杨婷
导　师: 段小红
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔基础医学
关键词: 氟成釉细胞内吞吞噬氯离子通道凋亡增殖
分类号: R739.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

地方性氟中毒是我国危害最严重的地方病,主要侵犯牙齿和骨骼,造成氟斑牙和氟骨症,严重危害人的健康和美观。氟斑牙是慢性氟中毒早期最常见的症状,产生氟斑牙最主要的原因是机体在釉质发育期间长期摄入了过量的氟,导致釉质发育障碍。其临床表现为同一时期萌出的牙齿釉质上出现白垩色到褐色的斑块,严重者有釉质缺损。研究表明,氟离子可以通过多种途径影响成釉细胞,包括细胞的增殖、凋亡,釉基质蛋白的合成和分泌,以及蛋白酶活性等。然而,氟离子对不同分化阶段的成釉细胞作用是否一致,其作用机理是什么尚不清楚。本研究选择小鼠成釉细胞样细胞系LS8作为研究对象,用视黄酸和地塞米松诱导LS8细胞建立体外成釉细胞的分化模型。通过实时定量PCR检测两种釉基质蛋白和两种蛋白酶的mRNA的表达水平,荧光标记的白蛋白检测细胞内吞功能,DND-167染料检测细胞内pH值等多种方法,比较诱导组细胞和对照组细胞的各种生物学特性的差异。结果发现,与对照组相比,诱导组细胞釉原蛋白和釉蛋白的表达分别下调了64%和61.1%(P<0.05),Mmp20和Klk4 mRNA的表达分别上调了1.42倍和2.41倍(P<0.05);诱导组细胞内吞的白蛋白的平均荧光强度为对照组的1.6倍(P<0.05),诱导组细胞内检测酸性pH的平均荧光强度为对照组的1.9倍(P<0.05),以上这些特征表明视黄酸和地塞米松诱导的LS8细胞具有转化期成釉细胞的特征,利用对照组和诱导组的LS8细胞可分别模拟成釉细胞的分泌期和转化期的研究模型。为了研究高氟对成釉细胞生长和增殖的影响,本研究通过MTT实验观察不同浓度的氟离子对LS8细胞增殖的影响,发现随着NaF浓度的增高,LS8细胞的增殖活性降低,这种作用在NaF作用72h时更为明显。当NaF浓度达到2mmol/L时,加氟后24h和48h细胞死亡率分别为30%和49%,而当NaF作用细胞72h,0.5mmol/L的浓度就可以引起37%的细胞死亡,说明毫摩尔剂量的氟离子会抑制成釉细胞的增殖。由此,我们确定了本研究高浓度氟离子的具体浓度为2mmol/L。细胞凋亡实验结果显示,视黄酸/地塞米松诱导组(20.43%)和NaF诱导组(19.01%)凋亡细胞(包括早期凋亡和晚期凋亡细胞)和死亡细胞的总比例均比对照组(14.23%)高(P<0.01),而RA/DEX +~NaF~+诱导组(10.83%)细胞凋亡/死亡则较对照组有所减少(P<0.01)。为了进一步准确测量悬浮细胞的活性,我们利用流式细胞仪来计数培养液中的悬浮细胞,RA/DEX +~NaF~+诱导组悬浮细胞数目最多,约为对照组的4.25倍(P<0.01);同时采用扫描电镜观察这些细胞表面的超微结构特征,发现RA/DEX +~NaF~+诱导组细胞失去了正常细胞的表面形态特征,细胞表面褶皱消失而变平,多数细胞倾向于连成一片,且其细胞平均直径较对照组显著变小(P<0.01)。通过以上结果我们认为高浓度的氟离子影响成釉细胞的生物学特性,如增殖和死亡,并且对转化期成釉细胞的作用更为明显。内吞作用是成熟期成釉细胞的重要特征,内吞功能异常在氟斑牙的发生中扮演着重要的角色。那么高氟对不同分化阶段的成釉细胞的内吞功能有何影响?为此,我们设计了吞噬实验,利用活细胞工作站动态观察细胞的吞噬活动, RA/DEX和NaF诱导组细胞发生吞噬作用的细胞数多于对照组(10个和21个vs. 6个),并且吞噬活动速度更快。RA/DEX +~NaF~+诱导组细胞发生吞噬作用的细胞数最多,80%以上的细胞都发生了吞噬作用,并且其吞噬速度在四组细胞中最快,绝大多数细胞都在15min内开始了吞噬活动,本实验说明高浓度的氟离子可以促进转化期成釉细胞的吞噬功能。目前还没有有力的证据表明存在特异的氟离子通道,一般认为,氟离子是通过氯离子通道来进出细胞的,那么氟对成釉细胞生物学特性的影响是否也是通过氯离子通道来完成的呢?为了验证这一假说,首先我们确定了LS8细胞中存在的氯离子通道类型;RT-PCR结果表明,成釉细胞表达8种ClC家族氯通道(Clcn1~7,Clcnkb),不表达Cftr。我们用2mmol/L的氟离子诱导LS8细胞后,通过实时定量PCR筛选对氟离子敏感的ClC家族氯通道,作用时间为24h和48h时,各型ClC通道的表达均有所增高,而当作用时间延长为72h,Clcn1、Clcn3和Clcn7三型ClC通道的表达分别增加了3.0倍、2.9倍和2.3倍(P<0.05)。通过细胞内pH检测,作用时间为24h、48h和72h时,反映细胞内酸性pH的平均蓝色荧光强度分别为对照组细胞的2.4倍、2.6倍和2.0倍(P<0.01),通过大量查阅文献我们发现,ClC-3和ClC-7与细胞内酸性pH的调节密切相关,由此,我们推断Clcn3和Clcn7可能对氟离子的作用更为敏感,其具体的机理我们将在下一步的研究中阐明。通过本研究,我们建立了研究氟离子对成釉细胞影响的体外实验模型,观察到了高浓度的氟离子对转化期成釉细胞作用更为敏感,发现氟离子通过干扰细胞的吞噬活动促进了细胞的凋亡与死亡,其机理与氯离子通道介导的细胞内酸化调节有关。本研究为氟斑牙的生物学产生机理增加了新的研究内容,从氯离子通道的角度重新审视了氟离子影响成釉细胞生物学特性的机制。

全文目录

缩略语表  7-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-17
前言  17-19
文献回顾  19-33
  一、地方性氟中毒概述  19-22
  二、氟离子对成釉细胞的影响  22-25
  三、氟离子的跨膜转运  25-26
  四、氯离子通道研究进展  26-31
  五、氯离子通道与氟离子关系  31-33
实验一成釉细胞体外分化模型的建立  33-46
  1 材料  33-34
    1.1 主要仪器  33
    1.2 主要试剂  33-34
    1.3 细胞系  34
  2 方法  34-39
    2.1 细胞培养  34-35
    2.2 RA/DEX 诱导细胞  35
    2.3 总RNA 提取  35-36
    2.4 反转录  36
    2.5 实时定量PCR  36-37
    2.6 内吞实验  37-38
    2.7 细胞内pH 值检测  38-39
  3 结果  39-42
    3.1 细胞形态  39
    3.2 釉基质蛋白和基质蛋白酶的表达  39-40
    3.3 细胞内吞功能  40
    3.4 细胞内pH  40-42
  4 讨论  42-46
实验二高氟对成釉细胞生长和增殖的影响  46-57
  1 材料  46-47
    1.1 主要仪器  46
    1.2 主要试剂  46-47
  2 方法  47-49
    2.1 MTT 实验  47-48
    2.2 细胞凋亡实验  48
    2.3 实时定量PCR  48-49
    2.4 悬浮细胞分析  49
  3 结果  49-55
    3.1 NaF 对LS8 细胞增殖的影响  49-51
    3.2 视黄酸/地塞米松和NaF 对细胞凋亡/死亡的影响  51-52
    3.3 悬浮细胞特征  52-55
  4 讨论  55-57
实验三高氟对成釉细胞吞噬活动的影响  57-62
  1 材料  57-58
    1.1 主要仪器  57
    1.2 主要试剂  57-58
  2 方法  58
  3 结果  58-60
  4 讨论  60-62
实验四成釉细胞氟敏感氯离子通道的筛选  62-70
  1 材料  62-63
    1.1 主要仪器  62
    1.2 主要试剂  62-63
  2 方法  63-65
    2.1 LS8 细胞系中氯通道基因 mRNA 水平的检测  63-65
    2.2 实时定量PCR  65
    2.3 细胞内pH 值检测  65
  3 结果  65-66
    3.1 LS8 细胞系中各种氯离子通道mRNA 的的表达  65-66
    3.2 高浓度氟离子对ClC 通道的筛选  66
    3.3 NaF 对LS8 细胞内pH 值的影响  66
  4 讨论  66-70
小结  70-73
参考文献  73-83
个人简历和研究成果  83-84
致谢  84

高氟对成釉细胞生物学特性影响的体外研究

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