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转录因子NFIC在人根尖牙乳头干细胞分化中的作用及其机制研究

作　者: 张菁
导　师: 牛忠英；何文喜
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔医学
关键词: 根尖牙乳头干细胞 转录因子 转化生长因子 细胞增殖 细胞分化 组织再生 煅烧牛骨
分类号: R781
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


干细胞在组织工程学中的运用将为牙髓/牙本质再生和生物性牙根的形成提供广阔的运用前景。根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla，SCAPs）位于未发育完成的年轻恒牙的根尖部，是一种取自正在发育组织的成体间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。SCAPs具有多向分化的潜能，在特定培养液诱导下可形成类牙髓/牙本质，且被认为是牙根部成牙本质细胞的来源，最终形成牙根部牙本质。SCAPs与牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）相比，具有较强的成牙分化能力和较低的免疫原形，此特性被认为更适合运用于骨/牙体组织再生领域。核转录因子NFIC（nuclear factor I-C）在调控牙根的发育中发挥了重要作用。敲除NFIC的小鼠，形成短小的磨牙牙根，而牙冠发育正常。鉴于NFIC是特异性调控牙根发育的信号分子，而SCAPs是牙根成牙本质细胞的来源，那么，NFIC在调控SCAPs分化中的作用及其机制如何，目前尚不清楚。牙齿的发育是由一系列上皮和间充质相互作用而形成，众多的细胞因子参与了牙齿发育的调控。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，包括TGF-βs，骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和激活素类等相关蛋白，参与调节细胞增殖、分化及上皮间充质转换和胚胎发育等。研究发现NFIC通过抑制TGF-β1调控的基因表达，影响皮肤伤口的愈合；敲除NFIC后，小鼠异常的成牙本质细胞中TGF-βⅠ型受体和磷酸化的Smad2/3显著上调，提示，NFIC可能参与TGF-β信号通路，但是两者是在调控SCAPs分化中的作用机制尚不清楚。本课题首先成功分离、培养和鉴定人根尖牙乳头干细胞。随后分别转染所构建的慢病毒NFIC真核表达载体或沉默NFIC的siRNA。通过体内、外实验观察NFIC对SCAPs增殖、分化的影响。最后，研究TGF-β1对SCAPs生物学特性及分化的影响，讨论NFIC与TGF-β1信号通路在SCAPs分化中的相互作用。为将来SCAPs在牙髓牙本质再生和生物性牙根方面的应用提供新的思路。结果如下：1.人根尖牙乳头感干细胞的分离、培养及鉴定选取因正畸原因而拔除的年轻患者第三磨牙，分离培养人原代SCAPs,有限稀释法纯化获得单克隆的细胞；免疫组织化学染色及流式细胞仪鉴定间充质干细胞标记物STRO-1等；成骨诱导、成脂诱导实验证实细胞的多向分化能力。2.转录因子NFIC促进SCAPs分化能力构建NFIC慢病毒真核表达载体plenti-NFIC后，与沉默NFIC的siRNA分别转染SCAPs。过表达NFIC还促进SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外，NFIC还不同程度地增强矿化基因标记物ALP、OCN和Col.I的mRNA；蛋白质印迹免疫检测技术也证实NFIC上调DSP蛋白水平。而沉默NFIC,则明显抑制SCAPs矿化能力及矿化基因ALP、OCN和Col.I的表达。此外，过表达NFIC增强脂滴的形成和成脂标记物CCAAT增强结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein）C/EBP-β、C/EBP-δ和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-γ）的表达。体内研究进一步证实：过表达NFIC的SCAPs细胞复合胶原/煅烧牛骨(calcinedbovine bone，CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后，可促进形成类成牙本质细胞和牙本质样结构。3.转录因子NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的调控不同浓度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和体外矿化结节形成，并下调矿化基因的表达，而分别应用TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂SB431542和Smad3的抑制剂SIS3阻断TGF-β信号通路后，可部分逆转TGF-β1对SCAPs增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表达，过表达NFIC减弱TGF-β1对SCAPs矿化能力的抑制作用，而沉默NFIC则增强了TGF-β1对SCAPs成牙/骨的分化能力。实验结果显示NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的生物学调控。综上所述，本研究通过体内/外实验证实NFIC可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖和分化能力；而TGF-β1则起抑制作用；且NFIC参与了TGF-β1对根尖牙乳头干细胞分化特性的调控。本实验结果为阐述NFIC在调控SCAPs定向分化中的重要作用；同时为进一步研究SCAPs在牙髓牙本质再生和生物学牙根的组织工程研究提供了新的研究思路。

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