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先天性白内障相关的βB2晶状体蛋白突变的致病机制研究

作　者: 徐佳
导　师: 姚克
学　校: 浙江大学
专　业: 眼科学
关键词: βB2晶状体蛋白先天性白内障基因突变蛋白质折叠蛋白质聚集
分类号: R776.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

βB2晶状体蛋白是人眼晶状体中重要的结构蛋白,与维持晶状体的透明性与屈光性密切相关,其潜在的生理功能尚不明确。目前国内外针对βB2晶状体蛋白基因突变导致先天性白内障的报道已有不少,但是针对突变具体的致病机制研究仍很缺乏。为了更好地阐明白内障的发生机理,从现有的与βB2晶状体蛋白相关的基因突变中,选取数个有意义的关键位点(位于蛋白N末端的突变A2V,以及四个与色氨酸相关的突变S31W、R145W、W59C、W151C),研究这些突变对pB2晶状体蛋白结构、稳定性、细胞内分布等方面的影响。通过PCR从人眼cDNA文库中克隆βB2晶状体蛋白的完整编码序列,构建野生型pB2晶状体蛋白和包含各突变位点的质粒,原核表达质粒采用pET28a,真核表达质粒采用pEGFP-C3和pcDNA3.1-flag;原核表达获取目标蛋白并纯化,采用生物化学和生物物理学研究手段,明确突变前后蛋白结构和理化性质方面的改变；并转染HeLa细胞,使野生型和突变型蛋白分别在细胞中过表达,观察蛋白在细胞内定位以及对细胞凋亡的影响。我们发现,A2V突变没有改变pB2晶状体蛋白的二、三级结构,却影响了蛋白的四级构象,破坏了蛋白同源四聚体的形成；降低了蛋白的热稳定性,使蛋白在高温下更容易聚集；不影响对抗化学变性剂和紫外辐射的稳定性,却使蛋白在复性过程更易发生聚集。W59C和W151C突变使βB2的疏水暴露增加,直接导致突变后蛋白的溶解度显著降低；S31W和R145W这两个突变则导致了蛋白热稳定性的明显下降；另外我们证实了色氨酸相关的突变影响了βB2晶状体蛋白对于紫外辐照的稳定性,除R145W外,其余三个突变体的稳定性较野生型下降,R145W却比野生型更能抵抗紫外能量的损伤；将四个突变体在HeLa细胞中过表达后,W59C和W151C在胞内出现了明显的聚集现象,这可能与它们的的溶解度有关,与蛋白水平的结果一致,说明溶解度下降很可能是这两个突变在出生即表现为白内障的原因。以上结果表明,βB2晶状体蛋白的N末端的突变会对自身的寡聚化造成影响,位于疏水核心的色氨酸残基突变会显著影响溶解度和稳定性,而结构域表面亲水的氨基酸突变为色氨酸后则会降低蛋白稳定性,促进蛋白聚集。据此认为,βB2晶状体蛋白基因突变导致的先天性白内障,其发病机制是多样的。

全文目录

致谢  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
主要符号对照表  10-11
目录  11-13
第1章绪论  13-24
  1.1 白内障  13-14
  1.2 βB2晶状体蛋白  14-20
  1.3 研究手段概述  20-23
  1.4 研究意义和研究内容  23-24
第2章实验材料与研究方法  24-43
  2.1 材料  24-26
  2.2 实验方法  26-43
第3章 A2V突变致病机制研究  43-56
  3.1 蛋白分子量及均一性  43-44
  3.2 突变对βB2晶状体蛋白天然状态下结构的影响  44-47
  3.3 A2V突变对蛋白质稳定性的影响  47-53
  3.4 βB2和βA3晶状体蛋白的相互作用  53-55
  3.5 本章小结  55-56
第4章色氨酸相关突变的致病机制研究  56-72
  4.1 蛋白分子量大小及均一性  56-57
  4.2 天然状态的蛋白结构  57-60
  4.3 蛋白稳定性变化  60-67
  4.4 细胞实验结果  67-71
  4.5 本章小结  71-72
第5章结论  72-74
参考文献  74-81
综述  81-92
  参考文献  87-92
攻读博士学位期间主要的研究成果  92

先天性白内障相关的βB2晶状体蛋白突变的致病机制研究

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