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遗传性白内障与基因突变和蛋白质功能改变

作　者: 李飞峰
导　师: 马旭
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 遗传学
关键词: 遗传性先天性白内障基因突变生物信息学蛋白质稳定性蛋白聚集
分类号: R776.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

一、研究目的:1.1、利用等位基因共享分析与定位候选克隆的策略,对两个临床表现类型不同的遗传性先天性白内障家系进行基因定位。1.2、对已经发现的基因突变,从生物信息学和蛋白结构与功能方面进行研究,分析疾病发生的分子生物学机制。二、研究方法:1.1、临床表型的研究1.1.1、知情同意后,采集静脉血5 mL。家系患者在北京同仁医院接受全身及眼部检查,非患者仅接受眼部检查。1.1.2、散瞳后经裂隙灯和眼底镜检查确定临床表型,对未手术患者进行眼部的图像数码采集和处理。1.2、基因定位的研究1.2.1、通过目前掌握的资料,分析遗传性白内障临床表型和基因突变位点,初步确定高怀疑基因突变位点。1.2.2、排除性分析,Linkage软件包计算LOD值,基因测序确定基因突变位点。1.2.3、DHPLC分析家系中所有患者、非患者以及100个与家系无关的正常人,进一步确定基因突变位点。1.3、生物信息学的研究1.3.1、Vector NTI、DNAMAN、BioEdit等生物信息学软件,以及NCBI、UCSC等数据库,分析基因和蛋白质的一般性质。1.3.2、Swiss-model software(version 3.5)、CLC protein workbench 3(version 3.0.2)、ExPaSy、Radar、Phyre software(version 0.2)等网络蛋白质预测软件,分析蛋白质突变型和野生型疏水性、复杂性等特殊性质的特点和差异。1.4、蛋白质结构与功能的研究1.4.1、调取目的基因的cDNA序列,点突变法构建突变型cDNA序列;原核表达野生型和突变型目的蛋白;分离纯化目的蛋白。1.4.2、远紫外圆二色(CD)光谱、内源和外源荧光、透射电子显微镜等于段,研究内源荧光光谱、外源荧光光谱、持续扫描光谱等,分析蛋白质野生型和突变型亲疏水性、稳定性和聚集等性质的特点和差异。三、主要结果:3.1、致病基因定位及其突变检测,首次发现CRYGD基因p.G61C突变可以导致遗传性先天性珊瑚型/核型白内障;首次发现BFSP2基因p.R339H突变可以导致遗传性先天性板层型白内障。3.2、生物信息学的研究发现:p.G61C突变和p.R339H突变位于进化保守区,使蛋白基本性质和氨基酸的组成比例发生变化;突变位点区域氨基酸测链、蛋白质亲疏水性、复杂性、疏水力矩和二级结构都发生改变,精氨酸和组氨酸pKr(R)值差异较大。3.3、蛋白质结构与功能研究发现:突变对蛋白的二级结构和三级结构影响不大,但使得CRYGD蛋白的稳定性显著降低。在蛋白质遭受热和化学变性剂时,突变体蛋白更容易发生变性,并伴随着严重聚集的出现,暗示稳定性的降低和更容易发生聚集可能与遗传表型相关。BFSP2蛋白的突变使得其体外组装的速度变慢,组装形成的纤维的单体数量变小,表明突变显著影响了BFSP2的正常生理功能。四、主要结论:4.1、先天性珊瑚型/核型白内障家系,突变基因为CRYGD基因,此临床表型在该基因中有很大的代表性;先天性板层型白内障家系,突变基因为BFSP2基因,此临床表型在该基因中首次发现,并且首次发现5号外显子上的突变位点。4.2、发现CRYGD基因的p.G61C突变以及BFSP2基因的p.R339H突变可以导致遗传性先天性白内障。4.3、p.G61C突变对CRYGD蛋白质三级结构的影响不明显,但60位点左右性质的改变可能会影响到整个蛋白质的亲疏水性和稳定性,进而影响到蛋白质的功能,进而导致白内障的生成;BFSP2基因p.R339H突变对蛋白质三级结构的影响不明显,但精氨酸和组氨酸pKr(R)值的较大差异、二级结构性质的改变以及339位点左右蛋白疏水力矩的改变,可能会影响到蛋白质的功能,进而导致白内障的生成。4.4、成功构建CRYGD基因野生型、BFSP2基因野生型、CRYGD基因p.G61C突变型、BFSP2基因p.R339H突变型的cDNA序列;利用大肠杆菌表达系统,得到CRYGD基因和BFSP2基因野生型和突变型蛋白,发现CRYGD蛋白为可溶性表达,BFSP2蛋白以包涵体形式表达;借助多种生物物理技术手段,分析了两种蛋白的生化和生物物理性质,发现CRYGD蛋白突变型比野生型更容易在胁迫下发生聚集、稳定性下降、环境耐受性下降,BFSP2蛋白突变型比野生型形成正常功能纤维的能力降低。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
缩写词表  11-12
前言  12-15
  1、遗传性先天性白内障的研究现状和特点  12-13
  2、晶状体蛋白质研究现状  13
  3、细胞骨架蛋白研究现状  13
  4、蛋白质的变性与去折叠  13
  5、本论文的意义和研究内容  13-15
第一章珊瑚型/核型先天性白内障与基突变和蛋白质功能的改变  15-55
  第一部分珊瑚型/核型白内障的致病基因定位及其突变检测  15-26
    1. 研究对象与实验材料  15
    2. 研究方法  15-18
    3. 研究结果  18-23
    4. 讨论  23-25
    5 附图  25-26
  第二部分 CRYGD基因突变所致白内障分子生物信息学的研究  26-35
    1. 研究目的  26
    2. 研究对象与方法  26
    3. 研究结果  26-33
    4. 讨论  33-35
  第三部分 CRYGD基因突变所致蛋白功能改变研究  35-55
    1. 研究对象与实验材料  35
    2. 研究方法  35-38
    3. 研究结果  38-45
    4. 讨论  45-47
    5 附图  47-55
第二章板层型先天性白内障与基因突变和蛋白质功能的改变  55-84
  第一部分板层型白内障的致病基因定位及其突变检测  55-62
    1. 研究对象与实验材料  55
    2. 研究方法  55
    3. 研究结果  55-59
    4. 讨论  59-61
    5 附图  61-62
  第二部分 BFSP2基因突变所致白内障分子生物信息学的研究  62-70
    1. 研究目的  62
    2. 研究对象与研究方法  62
    3. 研究结果  62-69
    4. 讨论  69-70
  第三部分 BFSP2基因突变所致蛋白功能的改变研究  70-84
    1. 研究对象与实验材料  70
    2. 研究方法  70-72
    3. 研究结果  72-77
    4. 讨论  77-79
    5 附图  79-84
第三章结论  84-86
  1. 论文总结  84-85
  2. 下一步工作  85-86
参考文献  86-98
文献综述:先天性白内障相关基因研究进展  98-103
附本论文中遗传分子标记及基因特异引物序列  103-107
附本论文所用溶液及其配制  107-110
个人简历硕士期间发表文章  110-112
致谢  112-113

遗传性白内障与基因突变和蛋白质功能改变

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