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胰腺星状细胞高表达Galectin-1促进胰腺癌免疫抑制及进展的研究

作　者: 汤东
导　师: 苗毅
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰腺癌胰腺星状细胞肿瘤免疫抑制 T 细胞 Galectin-1 CD3
分类号: R735.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景和目的：胰腺癌微环境是由间质细胞及细胞外成分共同组成，主要间质细胞包括：活化的胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSC）、内皮细胞、巨噬细胞等，其中PSC是其重要的间质细胞之一；主要细胞外成分包括：MMP-2（matrixmetalloproteinases-2）、MMP-9（matrix metalloproteinases-9）、TGF-β（transforminggrowth factor–）、VEGF （vascular endothelial growth factor）等细胞因子。胰腺癌微环境中PSC可以促进癌细胞的生长，同时可以增加癌细胞在体外对化学药物的抵抗性。另外，胰腺癌微环境中的细胞因子可以活化PSC，最终进一步促进有利于胰腺癌生长的微环境形成。Galectin-1是一种与β半乳糖有高度亲和性的凝集素蛋白，生物活性以二聚体形式存在于细胞内外。Galectin-1在细胞外通过与细胞膜表面受体和细胞外基质蛋白如整合素蛋白类（integrins）、层粘连蛋白（laminin）、纤维连接蛋白（fibronectin）等结合发挥效应，细胞内Galectin-1与细胞质蛋白与核蛋白结合后发挥细胞转化、mRNA剪切等功能。Galectin-1可以抑制T细胞的增殖，并可诱导肿瘤组织中浸润性T细胞凋亡。近来研究发现，Galectin-1显著表达在体外培养的激活状态PSC。而胰腺癌微环境中存在大量激活的PSC，但其内源性Galectin-1与胰腺癌免疫抑制之间的关系尚不清楚。本部分通过构建Galectin-1过表达/沉默的慢病毒载体并感染PSC，研究不同Galectin-1表达水平的原代PSC对T细胞功能和凋亡的影响，同时分析胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织标本中Galectin-1、CD₃的表达情况，以深入研究胰腺癌中Galectin-1表达与胰腺癌免疫抑制之间的关系。方法：1.分离和培养原代人PSC，对其用Desmin（静止期标志）和α-SMA（激活期标志）进行免疫组化染色鉴定。2.构建Galectin-1过表达/RNA干扰的慢病毒载体、感染PSC并筛选纯化，用荧光定量RT-PCR和Western Blot对感染后PSC中Galectin-1mRNA和蛋白表达水平进行鉴定，并用ELISA对各组PSC上清液中Galectin-1蛋白含量进行检测。3.分离培养健康志愿者外周血T淋巴细胞，不同Galectin-1表达水平（过表达、沉默、正常）的PSC与T细胞共培养，流式细胞仪检测T细胞凋亡及ELISA检测上清液中T细胞的细胞因子（IL-2、INF-γ、IL-4和IL-5）分泌情况。4.免疫组化检测66例胰腺癌、18例慢性胰腺炎和10例正常胰腺组织中Galectin-1和CD₃表达情况。结果：1.与正常PSC相比，Galectin-1过表达的PSC能显著诱导CD₃+T细胞凋亡（p<0.01）、CD₄+T细胞（p<0.01）和CD8+T细胞（p<0.05）凋亡；而Galectin-1沉默的PSC诱导CD₃+、CD₄+和CD8+T细胞凋亡的能力明显下降（p<0.05）。2.与正常PSC相比，Galectin-1过表达的PSC能显著抑制Th1细胞因子（IL-2和INF-γ）的分泌（p<0.01），并明显诱导Th2细胞因子（IL-4和IL-5）的分泌（p<0.01）；而Galectin-1沉默的PSC增加Th1细胞因子（IL-2和INF-γ）的分泌（p<0.01），减少Th2细胞因子（IL-4和IL-5）的分泌（p<0.01和p<0.05）。3.胰腺癌组织中Galectin-1和CD₃表达围绕在癌灶周围并显著高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织（p<0.01）。结论：1. PSC高表达Galectin-1促进T细胞凋亡，同时抑制Th1细胞因子（IL-2和INF-γ）的分泌，诱导Th2细胞因子（IL-4和IL-5）的分泌，至使Th1/Th2失衡。2.胰腺癌微环境中PSC高表达Galectin-1可形成肿瘤免疫抑制性屏障，诱导T细胞凋亡并抑制T细胞浸润，进而促使胰腺癌肿瘤免疫抑制的产生。研究背景和目的：Galectin-1作为Galectin家族中首先被发现的成员，与肿瘤的免疫抑制、肿瘤血管形成及肿瘤细胞增殖、侵袭和转移密切相关。Galectin-1在胰腺癌微环境中胰腺星状细胞上高表达。本部分研究通过检测胰腺癌组织标本中Galectin-1、CD3的表达情况，探讨胰腺癌微环境中Galectin-1表达与胰腺癌免疫抑制及胰腺癌侵袭、转移和预后之间的关系。方法：1.回顾性分析2006年1月至2010年12月之间南京医科大学第一附属医院66例经外科手术切除的胰腺导管腺癌患者的临床资料，其中不包括肿瘤广泛转移、不能进行手术切除的胰腺癌病人，以及患有其他胰腺恶性肿瘤的患者。2.用免疫组化染色方法检测相关胰腺癌标本中Galectin-1和CD3的表达情况。3. Kaplan-Meier曲线描述胰腺癌患者的生存期，并采用Log-rank检验对临床资料和数据进行统计分析4. Cox regression风险回归模型对胰腺癌预后和各临床参数进行单因素和多因素分析。结果：1.对66例患者的临床资料进行统计分析，随访结果显示患者生存时间4.7-47.0个月不等，中位生存期为16.2个月。2. Galectin-1表达与患者的年龄、性别和肿瘤神经侵袭没有直接关系，而与肿瘤T分期、淋巴结转移、UICC分期和组织学分级密切相关，并随着组织学分化程度降低而逐渐增高（强/弱表达分别为：高分化4/6例，中分化16/8例，低分化27/5例，p<0.05）；CD3表达与患者的年龄、性别、肿瘤神经侵袭、T分期和淋巴结转移无直接关系，与UICC分期和组织学分级密切相关，并随着组织学分化程度降低而逐渐降低（强/弱表达分别为：高分化8/2例，中分化13/11例，低分化9/23例，p<0.01）；Galectin-1表达与CD3表达呈负相关（p=0.001）。3. Galectin-1高表达和CD3低表达的胰腺癌患者预后较差，Galectin-1高表达和低表达的患者中位生存期分别为9.1个月和19.8个月（p<0.001）；CD3高表达和低表达的患者中位生存期分别为14.3个月和10.9个月（p<0.05）。4.单因素分析结果显示，胰腺癌术后的生存期与患者的年龄、性别、神经侵袭无关，与肿瘤的T分期、淋巴结转移、UICC分期、组织学分级、Galectin-1和CD3表达相关；多因素分析结果显示，肿瘤的淋巴结转移、UICC分期、组织学分级、Galectin-1和CD3表达是胰腺癌预后的独立风险因素。结论：1．Galectin-1表达与胰腺癌T分期、淋巴结转移、UICC分期和组织学分级密切相关，并随着组织学分化程度降低而逐渐增高；CD3表达与UICC分期和组织学分级密切相关，并随着组织学分化程度降低而逐渐降低。2.胰腺癌微环境中Galectin-1和CD3表达水平与患者预后密切相关，胰腺癌中Galectin-1表达升高则CD3表达下降，同时患者预后变差。3.胰腺癌的淋巴结转移、UICC分期、组织学分级、Galectin-1和CD3表达是胰腺癌预后的独立风险因素。

全文目录

第一部分  4-77
  中文摘要  4-7
  Abstract  7-11
  前言  11-14
  材料和方法  14-52
  结果  52-68
  讨论  68-71
  结论  71-72
  参考文献  72-77
第二部分  77-102
  中文摘要  77-79
  Abstract  79-82
  前言  82-84
  材料和方法  84-89
  结果  89-95
  讨论  95-97
  结论  97-98
  参考文献  98-102
全文小结  102-105
综述  105-130
  参考文献  120-130
附录  130-133
攻读学位期间发表文章情况  133-134
致谢  134

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