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去泛素化酶UCH37对肝癌复发的影响及其分子机制研究

作　者: 方颖
导　师: 沈锡中
学　校: 复旦大学
专　业: 消化内科
关键词: UCH37 肝细胞肝癌迁移侵袭 GRP78 PRP19
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

细胞内蛋白质泛素化和去泛素化调节的动态平衡参与了细胞生命活动的调节,包括细胞的代谢、分化、增殖等,还能选择性地降解或稳定癌基因、抑癌基因的产物、激活物或抑制物、凋亡调控蛋白等,达到调控细胞突变和肿瘤发生的目的。目前研究证实,泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases, UCHs)是细胞内的一种去泛素化酶。UCH家族有4个成员：UCH-L1、UCH-L3、 UCH37和BRCA1相关蛋白1(BRCA1-associated protein-1, BAP1)。现有研究表明,UCH-L1、 UCH-L3和BAP1与恶性肿瘤的发生、发展和预后相关,但至今尚未有UCH37和恶性肿瘤之间关系的报道。因此,本研究的目的是明确UCH37在原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的作用,并进一步探讨其分子作用机制。本论文分成三个部分：第一部分UCH37表达与人肝癌临床病理特征的关系及其对肝癌患者复发与预后的影响我们采用免疫组化染色方法检测了UCH37在90例肝癌组织和相应癌旁组织中的表达情况。结果显示,UCH37在肝癌组织中呈高表达；配对t检验结果显示,UCH37在肝癌组织中的表达水平明显高于相应的癌旁组织；在61例肝癌复发患者中,UCH37在肝癌组织中的表达水平亦明显高于相应的癌旁组织。随后,我们采用Cox风险比例模型,对HCC患者术后总体生存(overall survival, OS)相关危险因素和至复发时间(time to recurrence, TTR)相关危险因素进行了单因素和多因素分析。结果显示,除了以往研究中公认的HCC重要危险因素—肿瘤大小和血清AFP水平,被证实为HCC复发或生存的独立危险因素外,UCH37在肝癌组织中的免疫组化得分与相应癌旁组织中的得分之差大于等于2分,也被证实是影响肝癌患者根治术后TTR的独立危险因素。这一部分研究提示,UCH37是一个潜在的新型HCC预后分子标志物,且可能通过参与HCC的复发转移而在HCC的发展演进中发挥了重要作用。第二部分UCH37对肝癌细胞生物学行为的影响本研究部分构建了UCH37过表达和下调的稳定的单克隆细胞株,并对其进行了细胞功能实验研究。结果显示,与对照相比,UCH37能显著增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力；与对照相比,UCH37下调能显著抑制细胞的增殖；与对照相比,UCH37对肝癌细胞株的细胞周期和细胞凋亡的影响没有显著性差异；在裸鼠成瘤实验中,UCH37能促进肿瘤的形成。这一部分研究结果首次发现了UCH37具有促进肝癌细胞迁移和侵袭的能力,结合第一部分的临床研究结果,提示UCH37可能是通过调控肝癌细胞的迁移和侵袭能力,从而促进了肝癌术后的复发。第三部分UCH37促进肝癌复发的相关机制探讨在本研究部分中,一方面,我们应用原核细胞表达、纯化蛋白的技术,在体外得到了纯化的GST-UCH37融合蛋白,将此融合蛋白与Huh7细胞总蛋白进行GST-pulldown实验,沉淀产物行SDS-PAGE电泳,联合质谱技术和数据库搜索,筛选到了63个与UCH37相互作用的蛋白质。同时,我们应用免疫共沉淀技术在肝癌组织中分离和富集了与UCH37相互作用的蛋白质,沉淀产物进行SDS-PAGE电泳,联合质谱技术和数据库搜索,筛选到了22个与UCH37相互作用的蛋白质。通过分析两组数据,我们发现了一个共同的蛋白质,即驻留在内质网具有分子伴侣功能的葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein78,GRP78)。通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术证实了UCH37和GRP78之间存在相互作用。另一方面,我们应用蛋白质定量分析技术,即同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)，筛选到了一系列与UCH37相关的差异表达蛋白。结果显示,与对照细胞株相比,UCH37过表达的稳定的单克隆细胞株中有18个蛋白质上调,21个蛋白质下调。对这39个差异表达的蛋白质进行GO (Gene Ontology, GO)数据库和KEGG (Kyoto Encycl opedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析,结果显示,这些差异表达蛋白分布于细胞的各个亚单位,涉及各个方面的分子功能,参与了各种生物学过程,提示UCH37高表达后影响了一系列对细胞生命活动调节具有重要作用的蛋白质的表达。经过筛选,我们确定将参与前体mRNA剪接和双链DNA修复的蛋白质——PRP19,作为进一步研究的蛋白质。通过免疫共沉淀、激光共聚焦、小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)等技术,证实了UCH37通过与PRP19相互作用,对其去泛素化水平升高,使其泛素化降解减少,导致PRP19持续高表达,从而增强了肝癌细胞的迁移和侵袭能力。另外,这一部分研究筛选到了许多与UCH37相互作用或者受UCH37调控的蛋白质,为进一步探讨UCH37在肝癌术后复发中的作用机制提供了新的线索。综上所述,通过本研究,我们明确了去泛素化酶UCH37具有促进肝癌细胞迁移和侵袭的能力,并且是影响肝癌患者根治术后TTR的独立危险因素。同时,我们探讨了UCH37通过与PRP19相互作用,对其去泛素化水平升高,使其泛素化降解减少,导致PRP19持续高表达,从而增强了肝癌细胞迁移和侵袭能力,进而促进肝癌复发的具体分子机制,为肝癌复发的诊断和治疗提供了新的理论依据与实践基础。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-14
第一部分 UCH37表达与人肝癌临床病理特征的关系及其对肝癌患者复发与预后的影响  14-29
  材料与方法  14-17
  结果  17-27
  讨论  27-28
  小结  28-29
第二部分 UCH37对肝癌细胞生物学行为的影响  29-50
  材料与方法  29-41
  结果  41-48
  讨论  48-49
  小结  49-50
第三部分 UCH37促进肝癌复发的相关机制探讨  50-89
  第一节 UCH37相互作用蛋白质的初步筛选与鉴定  50-74
    材料与方法  50-58
    结果  58-72
    讨论  72-73
    小结  73-74
  第二节 UCH37相关的差异表达蛋白的筛选及其对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响  74-89
    材料与方法  74-77
    结果  77-86
    讨论  86-88
    小结  88-89
全文总结  89-90
参考文献  90-97
综述  97-115
  References  108-115
附录  115-116
致谢  116-118

去泛素化酶UCH37对肝癌复发的影响及其分子机制研究

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