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TGF-β信号通路参与肝癌发生发展的机制研究

作　者: 母小新
导　师: 孙倍成
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 转化生长因子-β 转化生长因子-β受体II型 Smad4 肝脏慢性炎症 肝癌
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）占据全球常见肿瘤的第五位，其致死率列全球高致死性肿瘤第三位，可分为肝细胞型(hepatocellular carcinoma，HCC)，胆管细胞型（cholangiocarcinoma，CC）和混合型三种类型，以肝细胞肝癌最为常见，导致肝癌的主要病因为慢性活动性肝炎（chronic active hepatitis），包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)导致的病毒性肝炎,酒精性肝炎(alcoholic hepatitis)及非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fattyliver disease, NAFLD)。而乙肝病毒感染导致的慢性病毒性肝炎是我国肝癌发生的最主要原因之一。持续性肝细胞死亡、炎症细胞浸润以及肝脏的代偿性增生被普遍认为是肝脏慢性炎症诱发肝癌的病理过程，而从分子信号通路的层面认识这一过程有利于新的肝癌治疗手段的开发。众多基于动物模型的研究表明，TGF-β信号通路在调控肝脏炎症促进肝癌发生过程中发挥重要作用，然而，多数结果仍未得到比较统一的结论，存在一定不解和迷惑。因此，本研究以大量人体慢性肝炎及肝癌标本为基础和一些在线数据库的结果，结合体外实验及动物实验模型，系统研究了TGF-β信号通路参与肝脏慢性炎症背景下肝癌发生发展过程中的分子机制，获得以下主要结果：1.基于大量人类肝癌临床标本和在线数据库的microarray结果分析了TGF-β信号通路中众多相关基因表达，研究表明TGF-β信号通路在人类肝癌中普遍失活，TβRI/II受体基因表达显著降低，抑制性Smad蛋白Smad7表达升高，通路下游基因显著灭活。2.同时，利用常用体外实验方法（Western Blot，Luciferase assay，琼脂糖生长实验，MTT等），检测实验室常见肝癌细胞系（SNU398，SNU423，HepG2，Sk-Hep-1和Huh7）的TGF-β信号通路活性状态，研究发现，与具有完整TGF-β信号通路的HepG2相比，Sk-Hep-1和Huh7具有相对完整的此通路，SNU423通路活性较弱，而SNU398的此通路不完整（通路受体II型未见明显表达），但有一定基础水平的活化通路蛋白（如p-Smad2, p-Smad3）。意外的发现是，所检测的5种肝癌细胞都持续分泌不同水平TGF-β（包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），外源性TGF-β可以不同程度抑制具有完整TGF-β信号通路的细胞增殖。3.在此基础上我们利用针对TGF-β通路关键受体分子TβRII的慢病毒介导的shRNA，导入肝癌细胞系SNU423和Sk-Hep-1，有效沉默其表达。体外实验研究结果表明，TβRII表达沉默后，细胞生长迟缓、凋亡显著增加。进一步使用皮下肿瘤细胞种植模型，植入TβRII基因沉默的Sk-Hep-1细胞和空白对照Sk-Hep-1细胞，体内实验发现肝癌生长受到抑制，并且利用尾静脉注射肿瘤细胞构建肿瘤转移模型，实验发现肿瘤转移同样受到抑制。4.为进一步验证沉默TβRII对细胞生长和凋亡的影响是通过Smad或非Smad通路的作用，我们利用针对Smad4的shRNA，导入肝癌细胞系Sk-Hep-1和Huh7，有效沉默其表达。体外实验研究结果表明，Smad4表达沉默后，细胞生长缓慢、凋亡显著增加。并且外源性TGF-β浓度依赖性阻止细胞周期进展，抑制肝癌细胞增殖的效应减弱；TGF-β诱导性上调p15的效应同样变弱。5.利用shRNA下调肝癌细胞系SNU423、Sk-Hep-1和Huh7的TGF-β信号，针对TβRII的shRNA诱导细胞凋亡，而针对Smad4的shRNA也一定程度地促进凋亡作用。其中的机制研究表明，针对Smad4和TβRII的shRNA能够显著抑制细胞核内L区磷酸化的Smad3（p-Smad3L）的表达；而针对Smad4的shRNA还能促进抑癌基因PTEN的表达，进一步使AKT去磷酸化，从而阐明了TGF-β通路阻断后抑制肝癌生长和肺转移的机制，其主要可能通过抑制经典的Smad通路。本研究从体内及体外研究揭示了TGF-β信号通路对肝癌生长及转移的影响及分子机制，为肝癌的基因治疗及药物开发提供了新的靶点。综上所述，通过体内外各项实验，我们获得的研究结果表明，TGF-β信号通路在肝脏慢性炎症促进肝癌发生过程中发挥核心作用，一方面，TGF-β在肝癌中灭活有利于肿瘤细胞逃避其抑制细胞增殖的作用，影响肝癌恶性程度及侵袭能力等生物学特性，另一方面，肝癌细胞自身逐渐建立起此通路，促进由此通路调控的炎症因子、趋化因子及生长因子等分泌，维持肿瘤细胞增殖和迁移所需的微环境。这些结果有利于我们更深入了解肝脏慢性炎症促进肝癌发生的机制，同时也为肝癌的预防和治疗提供了新靶标。

全文目录


缩略词  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
第一部分 肝癌细胞中 TGF-β信号通路与肝癌恶性特征相关性研究  13-44
  引言  13-17
  材料和方法  17-32
  结果  32-42
  小结  42-44
第二部分 TGF-β信号通路维持肝癌细胞稳定的作用机制研究  44-70
  引言  44-46
  材料和方法  46-55
  结果  55-70
  小结  70
讨论  70-73
综述  73-87
参考文献  87-108
发表论文  108-109
附录  109-124
致谢  124-125

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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