学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Gankyrin基因敲除结肠癌细胞模型的建立及其功能研究

作　者: 陈亮
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: Gankyrin 结肠癌 体细胞基因敲除 蛋白质组学
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 88次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


Gankyrin是一个近年来新发现的原癌基因。它所编码的蛋白质由226个氨基酸组成,包含7个锚蛋白（ankyrin）重复序列,是26S蛋白酶体的一个组份。Gankyrin能与Rb、p53、MDM2、RhoGDI等多个信号通路中的重要分子相互作用,在细胞转化、凋亡以及周期调控等多种生物学事件中发挥重要作用。目前已发表的文献显示了Gankyrin与肝癌、肺癌、胰腺癌、食道癌以及结肠癌等的相关性,其中对参与肝癌发生发展转移的具体机制研究的较为深入,而对其影响结肠癌发生发展的分子机制研究尚未见报道。我们新近对100例结肠癌及其邻近正常组织切片的病理分析结果表明Gankyrin在结肠癌组织中高表达,提示Gankyrin在结肠癌的发生发展中发挥重要作用。本项研究中我们通过同源重组基因打靶技术建立了完全敲除Gankyrin基因的人结肠癌细胞, HCT116 gankyrin-/-,从而获得了Gankyrin功能研究的重要工具细胞。在该细胞模型中我们发现敲除Gankyrin后HCT116细胞的转化、成瘤能力明显减弱;细胞生长变缓,周期同步化实验结果表明敲除细胞出现G1-S期进程延迟和G2/M期阻滞;此外,敲除Gankyrin后HCT116细胞的迁移能力减弱,相反稳定过表达Gankyrin的NIH3T3细胞迁移能力显著增强。为了进一步寻找相关的分子机制线索,我们对HCT116, HCT116 gankyrin-/-两种细胞进行了差异蛋白质组学分析,发现了17个表达水平受Gankyrin调控的蛋白质。其中包括蛋白质泛素化降解系统相关蛋白质UBE2T、蛋白质Neddylation所需的E2酶Ubc12、细胞周期相关蛋白质Spc25、p53相关分子PIG3以及细胞骨架蛋白调节分子Lasp1等。本研究加深了对细胞内Gankyrin调控网络的认识,为进一步明确Gankyrin在泛素蛋白酶体系统中的功能,阐明Gankyrin在结肠癌进程中的作用以及揭示结肠癌发生发展转移的分子机制提供了新的线索。

全文目录


缩略词表  6-7
摘要  7-8
Abstract  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-24
  1 材料及来源  12-13
    1.1 菌株和质粒  12
    1.2 实验动物  12
    1.3 主要试剂  12
    1.4 主要仪器设备  12-13
    1.5 细胞培养和转染  13
  2 实验方法  13-24
    2.1 免疫组织化学染色  13-14
    2.2 PCR 扩增同源臂  14-15
    2.3 重组腺相关病毒的包装和感染  15-16
    2.4 靶细胞的感染及中靶细胞的筛选  16
    2.5 PCR 鉴定中靶细胞  16-17
    2.6 Western blot  17
    2.7 Southern 印记杂交  17-18
    2.8 软琼脂克隆形成实验  18-19
    2.9 裸鼠成瘤实验  19
    2.10 细胞周期同步化  19-20
    2.11 流式细胞术分析细胞周期  20
    2.12 细胞迁移实验  20-21
    2.13 双向电泳蛋白质样品的制备  21
    2.14 双向电泳  21-22
    2.15 染色  22
    2.16 凝胶图像采集与分析  22
    2.17 电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)鉴定蛋白质  22-24
结果  24-44
  1. Gankyrin 在人结肠癌组织中的表达情况  24-26
  2. Gankyrin 基因敲除结肠癌细胞(HCT116 gankyrin~(-/-))的建立  26-32
    2.1 打靶载体的构建  26-28
    2.2 rAAV 介导的基因打靶以及阳性克隆的筛选鉴定  28-30
    2.3 抗性筛选元件的切除及Southern 鉴定  30-32
  3. Gankyrin 敲除对结肠癌细胞转化和成瘤能力的影响  32-33
  4. Gankyrin 敲除对结肠癌细胞生长速度和周期进程的影响  33-38
    4.1 HCT116 gankyrin~(-/-)细胞生长速度变缓  33-34
    4.2 HCT116 gankyrin~(-/-)细胞G1-S 期进程滞后  34-36
    4.3 HCT116 gankyrin~(-/-)细胞G2/M 期阻滞  36-38
  5. Gankyrin 对细胞迁移能力的影响  38-39
  6. HCT116 与HCT116 gankyrin~(-/-)细胞差异蛋白质组学比较  39-44
    6.1 HCT116 与HCT116 gankyrin~(-/-)细胞蛋白质差异图谱的建立  39-41
    6.2 差异蛋白质的质谱鉴定  41-44
讨论  44-52
参考文献  52-58
总结  58-60
文献综述  60-74
  参考文献  69-74
个人简历  74-75
致谢  75-76

相似论文

  1. 棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究,S562
  2. 陆地棉细胞质雄性不育及其恢复机制的研究,S562
  3. 阿斯匹林、姜黄素对人HT-29、SW480细胞中β-catenin、COX-2及PGE2的影响,R735.35
  4. 阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29、SW-480中肿瘤干细胞相关标记物的影响,R735.35
  5. 乙型肝炎病毒相关性肾炎尿液蛋白质组学的研究分析,R692.3
  6. 虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞体外增殖的影响,R735.35
  7. 微波消融联合5-FU对小鼠结肠癌移植瘤治疗的实验研究,R735.35
  8. 正常肝细胞系Chang Liver和肝癌细胞系HepG2的定量蛋白质组学研究,R735.7
  9. 须癣毛癣菌肉芽肿株、体癣株生物学性状，基因分型，比较蛋白质组学的研究,R756
  10. 阿托伐他汀联合塞来昔布对人结肠癌SW-480细胞增殖和凋亡的影响,R965
  11. 人结肠癌组织中B7-H4的表达及其临床意义,R735.3
  12. B7-H1/PD-1在人结肠癌中的表达及其与调节性T细胞关系的研究,R392
  13. TNF-α、IL-23在结肠息肉及结肠癌中的表达及意义,R735.35
  14. 紫杉醇敏感与耐药乳腺癌细胞中7种蛋白质的表达,R273
  15. 间斑寇蛛电刺激粗毒的蛋白质组学分析,Q51
  16. 内毒素休克小鼠肝脏线粒体差异蛋白质组的鉴定,R459.7
  17. 激光捕获显微切割纯化的人正常支气管上皮与肺鳞癌组织的定量蛋白质组学研究,R734.2
  18. 溶藻弧菌耐四种抗生素的蛋白质组学研究,S941
  19. 宫颈癌血清差异蛋白的表达及宫颈癌HeLa细胞放射前后的蛋白质组学初步研究,R737.33
  20. 大鼠海马细胞质膜蛋白质组学研究及二维色谱在毒素组学研究中的应用,Q51
  21. 槲皮素对人大肠癌SW480细胞侵袭及转移作用的体外实验研究,R285

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com