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TROP2在非小细胞肺癌中的表达及其意义

作　者: 顾宇平
导　师: 黄建安
学　校: 苏州大学
专　业: 呼吸内科
关键词: 人滋养层细胞表面抗原-2 非小细胞肺癌 RNA干扰
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分TROP2在非小细胞肺癌中的表达及其与CD133的相关性目的检测人滋养层细胞表面抗原-2（TROP2）在非小细胞肺癌（NSCLC）组织和细胞系中的表达，分析其与临床病理因素和预后的关系，同时探讨其与肿瘤干细胞标志物CD133的关系。方法用流式细胞术检测5株NSCLC细胞系、1株永生化正常人支气管上皮细胞系中TROP2的表达，RT-PCR检测22例术后NSCLC肿瘤组织及其癌旁组织，免疫组化检测98例NSCLC术后组织中TROP2和CD133的表达，并结合临床病理因素及预后进行分析，以免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察其定位和共定位。结果5株NSCLC细胞系中H1975、SPCA-1、PC-9有TROP2表达，A549、H1299及正常人支气管上皮细胞系HBE中无表达。TROP2mRNA的表达阳性率为68.2%（15/22）。免疫组化显示TROP2、CD133蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率分别为42.86%（42/98）和29.59%（29/98），均明显高于癌周正常肺组织及肺良性病变组织（P<0.01）；二者均表现为细胞分化程度越低表达阳性率越高，CD133达到统计学差异（P=0.02），TROP2未达到统计学差异（P=0.11）；TROP2、CD133的阳性表达率在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（P=0.02, P=0.03），TROP2、CD133的阳性表达率随着TNM分期的升高而升高（P=0.045, P=0.045）。TROP2、CD133在NSCLC中的表达具有密切相关性（P=1.87E-05），且两种蛋白有共定位现象。TROP2与NSCLC患者术后生存期呈负相关趋势，但差异未达到统计学意义（P=0.076）。结论TROP2在NSCLC组织和细胞系中均有较高表达，并与肿瘤干细胞标记物CD133存在共定位关系，TROP2可能在NSCLC的发生发展中发挥重要作用。第二部分靶向TROP2的小干扰RNA慢病毒载体的构建与包装目的构建并制备携带靶向TROP2基因shRNA的高滴度慢病毒载体。方法根据TROP2基因序列设计4条siRNA作为干扰靶点，分别构建4个shRNA慢病毒（Lentivirus, LV）表达载体并通过筛选选择一条干扰率最高的序列，用含有此序列的GV248载体（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）及二种辅助包装质粒pHelper1.0载体、pHelper2.0载体共转染293T细胞，进行病毒包装成LV-TROP2-shRNA，并进行滴度测定。结果靶向TROP2的shRNA片段成功包装入慢病毒载体，病毒滴度为1E+9TU/ml，达到进一步实验要求。结论成功制备了LV-TROP2-shRNA的高滴度慢病毒载体。第三部分RNA干扰抑制TROP2表达对NSCLC生物学行为影响的体外研究目的LV-TROP2-shRNA载体转染NSCLC细胞系PC-9，并进行内源验证，进一步观察LV-TROP2-shRNA对PC-9细胞的体外作用。方法LV-TROP2-shRNA慢病毒载体转染PC-9细胞，流式细胞仪（FCM）检测转染效率，Real-time PCR检测TROP2的基因敲减情况。实验分三组：PC-9组(未感染任何病毒的正常目的细胞PC-9)，PC-9/Con组(空载体病毒转染组)，PC-9/shRNA组(转染LV-TROP2-shRNA)。CCK-8比色法检测细胞增殖能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果LV-TROP2-shRNA的转染效率达90％以上且稳定表达，TROP2在mRNA水平的敲减率达65％以上。48小时后PC-9/shRNA组细胞的增殖抑制作用趋于明显（P<0.05）。划痕实验中PC-9/shRNA组划痕宽度较其它二组显著增宽(P<0.001)。Transwell侵袭实验中，相对于PC-9组和PC-9/Con组的结果之间无明显差异(P>0.05)，PC-9/shRNA组的侵袭细胞数明显减少（P<0.05）结论LV-TROP2-shRNA成功稳定感染NSCLC细胞系PC-9，体外实验证实，LV-TROP2-shRNA对于PC-9细胞的增殖、迁移、侵袭能力有抑制作用。第四部分TROP2在肺癌发生、发展中作用的体内研究目的研究LV-TROP2-shRNA对PC-9荷瘤SCID小鼠模型生长行为的影响。方法分别将三组细胞（分组同前）接种SCID鼠，建立人源化SCID鼠肺癌模型，半定量RT-PCR和Western blot检测小鼠肿瘤组织TROP2mRNA和蛋白表达变化。检测抑制TROP2表达后，SCID鼠的体重、移植瘤的生长速度变化。移植瘤的HE染色及免疫组化检测TROP2、Cyclin D1的表达情况。结果实验发现三组荷瘤鼠体重无明显差异。皮下移植瘤生长PC-9组和PC-9/Con组的之间无明显差异（P>0.05），PC-9/shRNA组明显受抑制（P<0.05）。RT-PCR和Western blot检测证实皮下移植瘤TROP2的表达受抑（P<0.01），免疫组化显示PC-9/shRNA组TROP2、Cyclin D1蛋白表达减少。结论在体内实验中证实，LV-TROP2-shRNA能够抑制PC-9荷瘤SCID小鼠移植瘤中TROP2mRNA和蛋白的表达，并显著抑制移植瘤的生长，可能与抑制移植瘤Cyclin D1的表达继而导致细胞生长周期受阻有关。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-12
前言  12-14
第一部分 TROP2 在非小细胞肺癌中的表达及其与 CD133 的相关性  14-32
  材料  14-16
  方法  16-22
  结果  22-27
  讨论  27-29
  结论  29-30
  参考文献  30-32
第二部分靶向 TROP2 的小干扰 RNA 慢病毒载体的构建与包装  32-59
  材料  32-33
  方法  33-47
  结果  47-54
  讨论  54-56
  结论  56-57
  参考文献  57-59
第三部分 RNA 干扰抑制 TROP2 表达对 NSCLC 生物学行为影响的体外研究  59-75
  材料  59-60
  方法  60-66
  结果  66-72
  讨论  72-73
  结论  73-74
  参考文献  74-75
第四部分 TROP2 在肺癌发生、发展中作用的体内研究  75-85
  材料  75
  方法  75-77
  结果  77-80
  讨论  80-82
  结论  82-83
  参考文献  83-85
全文总结  85-86
综述  86-105
  参考文献  99-105
全文缩略词  105-106
攻读学位期间公开发表的论文  106
基金资助  106-107
致谢  107-108

TROP2在非小细胞肺癌中的表达及其意义

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