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中药止痛贴镇痛机制研究

作　者: 姜涌
导　师: 王文萍
学　校: 辽宁中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 骨癌痛脊髓受体信号转导途径星形胶质细胞吗啡扶他林中药止痛贴
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：癌痛作为不同于炎性痛和神经病理性痛的一种特有的疼痛，是临床癌症患者晚期最常并发的疼痛，常见于乳腺癌、肺癌、前列腺癌晚期等，严重影响癌症患者的生活质量，并在一定程度上缩短患者的寿命，因而受到广泛重视。西医现有治疗措施的局限性及毒副作用，使45%的癌症患者的疼痛不能得到有效控制。中药止痛贴经实验研究及临床应用，均证明其治疗疼痛有确切的疗效，其选用延胡索、红花、马钱子、青风藤、桃仁等药物，具有辛散温通、通络散结、活血化瘀、消肿止痛等功效。但其作用机制尚不清楚，本研究通过建立骨癌痛模型，应用行为学、影像学、病理学和免疫组化技术等方法探讨中药止痛贴对抗癌痛的作用及可能机制。材料与方法：1．大鼠骨癌痛模型的建立方法：选择雌性Wistar大鼠178只，随机分为6组，分别为正常对照组（28只），假手术组、模型组、中药止痛贴组、吗啡组、扶他林组，每组各30只。造模方法：模型组、中药止痛贴组、吗啡组、扶他林组共120只，按照Medhurst等的方法制作胫骨癌痛模型，大鼠麻醉后仰卧位捆绑，从左侧胫骨上部切开皮肤，分离皮下组织直至暴露胫骨，使用牙科手转在胫骨上部打孔，后用10μl微量注射器向骨髓腔内缓慢注入Walker256肿瘤细胞液5μl（肿瘤细胞约5×105），再向其中注入空气1μl，然后以无菌骨腊封堵针孔，局部用庆大霉素冲洗，创口涂用红霉素软膏。假手术组，接种相同容量的PBS液，其余操作同模型组。正常对照组不予任何处理。检测指标：一般状态观察、疼痛行为学检测（包括术前和术后的自发痛行为观察、机械性触诱发痛及热痛过敏的缩爪阈值检测）、影像学检查（局部Ｘ线摄片）、病理组织学检查（取材局部骨组织切片，进行苏木素-伊红染色）。其中机械性触诱发痛及热痛过敏的缩爪阈值分别在术前和术后每周测定。影像学检测和病理组织学检测可以观察骨质破坏情况。通过以上指标的结果最终判定造模是否成功，以及药物镇痛治疗是否有效。2．中药止痛贴镇痛机制研究方法：选择雌性Wistar大鼠178只，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、中药止痛贴组、吗啡组、扶他林组，每组30只。造模大鼠左侧胫骨上段骨髓腔注入5μl（肿瘤细胞约5×105）。假手术组：左侧胫骨上段骨髓腔注入等量PBS液；正常对照组：不予任何处置。从术后第7天开始各组按实验方案分别给予中药止痛贴、吗啡、扶他林进行治疗干预。术前测定6组大鼠手术侧后爪机械性触诱发痛及热痛过敏的缩爪阈值，术后1～21d每周（术后7、14、21d）在测定手术侧后肢机械触性诱发痛及热痛过敏的缩爪阈值后，各取至少8只大鼠，使用4％多聚甲醛灌流，取大鼠脊髓L4-6节段，采用免疫组织化学方法检测以下指标在骨癌痛大鼠腰段脊髓中的分布及组织定位：（1）受体及受体效应酶：NMDAR2B（N-甲基-D-天冬氨酸2B受体）、NK1（神经激肽1受体）、ACⅧ（腺苷酸环化酶Ⅷ）、COX-2（环氧化酶2）。（2）细胞内信号转导途径：PKA（蛋白激酶A）、pCaMKⅡ（磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ）、pERK（磷酸化细胞外信号调节激酶）、p-p38（磷酸化p38）。（3）核内转录与蛋白翻译表达：pCREB（磷酸化cAMP反应元件结合蛋白）、Fos蛋白。（4）骨癌痛特征性改变的检测指标： GFAP（星形胶质细胞胶质源性酸性纤维蛋白）。3．统计学方法成组数据用mean±s表示，n代表样本数。组间比较用方差分析(Two-way RepeatedMeasures ANOVA)，同组间不同时间点数据比较用方差分析(One-way ANOVA)，当P＜0.05时认为差别存在统计学意义。各组率的比较用X2检验，两组间比较，经X2分割计算，P＜0.005时认为差别存在统计学意义。应用的统计分析软件为SPSS11.0。结果：1．大鼠骨癌痛模型的建立结果：（1）疼痛行为学观察：①自发痛行为观察：造模后大鼠术侧肢体负重能力随骨癌的进展逐渐降低，至骨癌后期，术侧肢体处于持续的蜷缩状态，病鼠可表现为拖足行走。对侧肢体、正常对照组及假手术组未见此现象出现。正常对照组在整个实验观察期内双侧后肢均未观察到明显缩足行为。假手术组术侧术后3d开始有缩足行为，与基础值相比有差异（P＜0.05），但1周后基本消失。模型组术侧术后3d开始有缩足行为，与假手术组相比无差异（P＞0.05），7d左右自发缩足次数明显增多，且缩足累计时间在观察期内逐次延长，术后第3、7、10、14d观察到的缩足时间分别为45.94±20.78s，95.32±24.92s，156.39±23.52s，237.72±27.51s，与正常对照组和假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。②机械性触诱发痛（MWT）及热痛过敏（PWT）的缩爪阈值：术后1～6d，模型组大鼠术侧后爪的机械性触诱发痛和热痛过敏缩爪阈值与正常对照组比较无统计学差异（P>0.05）；术后14～21d，模型组大鼠手术侧后爪的机械性触诱发痛和热痛过敏缩爪阈值均较正常对照组降低（P＜0.05）。（2）影像学检查：Ｘ光片显示，模型组大鼠术侧胫骨出现明显的骨质破坏，其破坏程度与造模时间程正相关。模型组大鼠在术后第7d仅见注射部位骨髓腔内密度稍低，未见明确的骨质破坏区；术后第14d观察到局部骨密度不均，并出现少量骨皮质缺失；术后第21d可见骨质破坏程度明显加重，骨皮质缺失更加明显，甚至发生骨折。假手术组术侧、正常对照组及模型组对侧后肢在术后第7、14、21d均未观察到骨质破坏现象发生。（3）病理组织学检查：术后第7、14、21d分别取材，将术侧后肢胫骨接种局部做石蜡切片，经HE染色显示，术后7d，胫骨骨髓腔内肿瘤细胞生长活跃，但骨皮质、骨小梁完整，未见明显骨质破坏；14d骨髓腔内大量肿瘤细胞浸润，骨小梁破坏，骨皮质出现缺失、变薄；21d骨皮质严重缺损，髓腔内充满肿瘤细胞，且穿破骨皮质向外生长，侵犯周围肌肉组织。而假手术组、正常对照组骨质完好、组织无破坏。经多方面、多角度评价，确认骨癌痛造模成功。2．药物镇痛效用评价结果：机械性触诱发痛（MWT）和热痛过敏（PWT）缩爪阈值：术后1～6d，造模各组大鼠术侧后爪的MWT和PWT与正常对照组、假手术组和基础值比较无统计学差异（P＞0.05）；术后7d开始，模型组、中药止痛贴组、吗啡组、扶他林组开始下降，与正常对照组比较差异存在统计学意义（p＜0.05），模型组至术后21d持续下降（p＜0.05）。吗啡组和扶他林组术后14d可见增高（p＞0.05），术后21d又出现降低（p＜0.05），而正常对照组和假手术组与基础值比较差异无统计学意义（p＞0.05）。中药止痛贴组于术后14～21d可见MWT和PWT增高（p＜0.05）。正常对照组、假手术组与基础值比较无统计学差异（p＞0.05）。3．中药止痛贴镇痛机制研究结果：免疫组化显示，（1）NMDAR2B、NK1、ACⅧ、COX-2、PKA、pCaMKⅡ、pERK、p-p38、pCREB、Fos、GFAP检测，模型组绝大多数在术后14～21d各种指标的免疫反应阳性神经元细胞或阳性细胞比值逐步升高，与正常对照组、假手术组比较存在统计学差异（p＜0.005）。（2）吗啡组在干预早期（7d）可见NMDAR2B、NK1、COX-2、PKA、pCaMKⅡ、pCREB、Fos阳性神经元比值下降，与正常对照组、假手术组比较差异无统计学意义（p＞0.005），但随着用药时间的延长，干预14d又见升高，与正常对照组和假手术组比较差异存在统计学意义（P＜0.005）。ACⅧ在吗啡干预早期即见增高，并持续至干预结束，与正常对照组和假手术组比较差异存在统计学意义（p＜0.005）。pERK、p-p38在吗啡干预早期即见下降，并持续至干预结束，与正常对照组及假手术组比较无统计学差异（p＞0.005）。GFAP在吗啡干预早期即出现升高，直至干预晚期，与正常对照组比较差异有统计学意义（p＜0.005）。（3）扶他林组药物干预7d，可见NMDAR2B、PKA、pCaMKⅡ、pERK、p-p38、pCREB、Fos阳性神经元比值下降，与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义（p＞0.005），但之后出现缓慢升高，与正常对照组、假手术组比较存在统计学意义（p＜0.005）。NK1在扶他林干预早期即见其阳性神经元比值增高，并持续至扶他林干预结束，与正常对照组合假手术组比较差异存在统计学意义（p＜0.005）。ACⅧ和COX-2在扶他林干预早期即见其阳性神经元比值降低，并持续至扶他林干预结束，与正常对照组合假手术组比较差异无统计学意义（p＞0.005）。GFAP在扶他林干预早期即出现升高，直至干预晚期，与正常对照组比较差异有统计学意义（p＜0.005）。（4）中药止痛贴（CM）组于药物干预7d即可见NMDAR2B、ACⅧ、COX-2、PKA、pCREB、Fos、GFAP指标下降，直至干预14d结束，与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义（p＞0.005）。pCaMKⅡ、pERK、p-p38在中药止痛贴干预7d时，其阳性神经元比值仍然较高，与正常对照组和假手术组比较差异存在统计学意义（p＜0.005），干预14d才开始出现下降，与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义（p＞0.005）。NK1则表现为早期下降，后期增高（p＜0.005）。结论：1．中药止痛贴一方面通过影响NMDA和NK1受体的活性，进而阻断细胞内信号转导途径，减少核内转录与翻译，另一方面通过抑制星形胶质细胞活化，减少兴奋性神经调质和前炎症介质的释放来抑制中枢敏化的形成，从而发挥镇痛作用。2．吗啡在干预早期可以抑制NMDA和NK1受体的活性，阻断细胞内信号转导途径，减少核内转录与翻译，后期次作用则由抑制表现为激活。此外，其干预早期即可激活星形胶质细胞，从而导致其镇痛效果逐渐减弱，并出现痛阈降低的现象，表现为痛觉异常和痛觉过敏。3．非甾体类镇痛消炎药物表现为抑制NMDA受体和COX-2的活性，阻断细胞内信号转导途径，减少核内转录与翻译，此外，其干预早期即可激活星形胶质细胞，因而随着病情的发展，效果逐渐减弱，其镇痛作用有限。

全文目录

摘要  4-9
Abstract  9-17
前言  17-20
文献综述  20-36
  1．非甾类消炎药（NSAIDs）  21-24
  2．阿片类镇痛药  24-28
  3．镇痛辅助药物  28-32
  参考文献  32-36
1 实验材料  36-39
2 实验方法  39-44
3 结果  44-82
分析讨论  82-104
结论  104-105
参考文献  105-116
致谢  116-117
个人简历  117

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