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利用亲和层析法检测乙酰化蛋白的研究

作　者: 郑力
导　师: 何敏
学　校: 广西医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 组蛋白乙酰化曲古菌素A 亲和层析柱 Jurkat细胞
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

蛋白乙酰化与肿瘤的发生发展有密切关系,由乙酰化转移酶引起的蛋白乙酰化逐渐被认为是一种重要的生物调控修饰。乙酰化状态取决于组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HATs)与组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)之间的活性竞争。HDAC抑制剂会使染色质组蛋白乙酰化水平提高,因此导致特定基因激活表达,相应地导致细胞的末端分化或癌细胞的凋亡。初步的临床研究表明,人类可以安全地通过抑制HDAC的活性来获得组蛋白高乙酰化水平,HDACs已经成为抗癌新药开发的热门靶点,而研发这一类抗癌新药的前条件之一就是要建立适应于药物筛选所用快速、相对定量检测乙酰化蛋白方法。目的：旨在建立一种快速、相对定量检测乙酰化蛋白方法,并初步探讨其应用。方法：本文用乙酰化蛋白标准品寻找最优的质谱前处理方案,并将其应用于检测乙酰化蛋白方法的建模。模型建立如下：不同浓度的曲古菌素A(Trichostatin A.TSA)于不同的时间段刺激不同数量的Jurkat细胞,诱导其蛋白高乙酰化后,使用抗乙酰化赖氨酸抗体亲和层析柱富集纯化乙酰化总蛋白,经酸洗脱后固定于酶标板,ELISA检测乙酰化蛋白相对总量,并用MALDI-TOF-TOF分析验证其成分。然后利用该方法初步检测不同浓度的没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A作用Jurkat细胞后乙酰化总蛋白水平的变化。结果：1μmol/L的TSA作用于4×105Jurkat细胞24h,乙酰化总蛋白相对水平最高。MALDI-TOF-TOF分析显示,TSA诱导Jurkat细胞产生的乙酰化蛋白共有22种,其中15种为乙酰化组蛋白。没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A作用于Jurkat细胞后所导致的乙酰化程度不同,以1μmol/L浓度TSA为阳性对照组,无药物为空白对照组,35.09μmol/L和17.54μmol/L大黄素处理的Jurkat细胞蛋白乙酰化相对水平分别为4.3%和14.2%；1.47μmol/L和2.94μmol/L没食子酸处理组相对蛋白乙酰化水平分别为28.7%和11.5%；152.91μmol/L和30.58μmol/L单乙酰化大黄素组分别为22.0%和3.6%。其中1.47μmol/L没食子酸所诱导的乙酰化水平最高。结论：初步建立了活细胞基础上纯化富集并检测乙酰化总蛋白水平的方法,该法可快速、简便的筛选以组蛋白去乙酰化酶为靶点的抗癌药物。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-12
材料和方法  12-28
结果  28-48
讨论  48-52
参考文献  52-61
综述  61-69
  参考文献  66-69
主要缩略词  69-70
致谢  70-71
攻读学位期间发表的学术论文  71

利用亲和层析法检测乙酰化蛋白的研究

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