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HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究

作　者: 李琳
导　师: 朱焕章
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: HIV-1 潜伏感染模型 Jurkat细胞 HIV-1 B/C重组亚型造血祖细胞(HPCs)
分类号: R512.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

高效抗逆转录病毒疗法有效地抑制了HIV的病毒复制,减缓了疾病进程,但并不能彻底清除HIV。这其中重要的原因在于由HIV潜伏感染细胞构成的病毒储存库的存在。而建立HIV潜伏感染相关的各种体外细胞模型,则有助于阐明HIV潜伏储存库的形成机制以及用于清除储藏库的药物筛选。此外,国外对HIV-1能否感染造血祖细胞尚未定论,中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能否感染人造血祖细胞也未见报道,对该问题的探讨也将为建立HIV-1在造血祖细胞上的潜伏模型奠定基础。鉴于此,本课题利用分子生物学、细胞生物学及病毒学等方法手段,对上述问题进行了如下研究：在第一部分的研究中,首先,我们制备了一种表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的HIV-1假病毒。采用离心感染的方式以106TCID50的病毒剂量感染人Jurkat T细胞后,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群。然后,经激活剂(200 nM TSA和10ng/ml PMA)刺激,用流式细胞术再次分选出GFP+细胞,并通过有限稀释法制备并筛选获得5个单克隆细胞系。最后,对这5个单克隆细胞系在激活剂刺激前后HIVp24抗原的表达进行了检测,并进一步用巢式Alu-LTR PCR的方法证实了这些单克隆细胞系基因组中整合有HIV-1的基因组。这些结果显示出我们已成功地建立了HIV-1潜伏感染细胞模型。该模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制打下了工作基础,也为建立HIV-1其他类型细胞潜伏感染模型奠定了基础。在第二部分的研究中,首先,我们从健康产妇的脐带血中用免疫磁珠法分离获得纯度为95-99%且具备多向分化能力的造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells,HPCs)。然后,制备HIV-1 B/C重组亚型的假病毒,采用不同剂量(50 TCID50、200 TCID50、1000 TCID50)的假病毒感染CD34+ HPCs,在多个时相点上用Elisa方法检测细胞上清中p24的表达水平,结果显示出p24的表达水平与其感染病毒剂量高低有关；Alu-LTR PCR检测结果显示出HIV-1病毒基因能够整合在宿主基因组上。这些研究结果提示了中国流行株HIV-1 B/C重组亚型能够感染人脐带血造血祖细胞。最后,我们进一步用流式直标抗体染色及Real-time PCR方法对CD34+ HPCs上受体的表达进行了检测,其结果显示CD34+ HPCs亚群不同程度上有HIV-1感染所需的CD4、CR5和CXCR4等受体的表达,提示了HPCs这些表面受体的存在可能是被HIV-1感染的原因。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
第一部分  7-35
  1、前言  7-8
  2、材料与方法  8-18
  3、实验结果  18-31
    3.1 HIV-1假病毒的制备和滴度检测  18-20
    3.2 HIV-1假病毒感染Jurkat细胞的条件优化  20-23
    3.3 HIV-1假病毒感染Jurkat细胞后的GFP细胞分选  23-24
    3.4 GFP-细胞的激活实验(潜伏感染细胞的激活)  24-25
    3.5 潜伏感染单克隆细胞系的制备  25-26
    3.6 潜伏感染单克隆细胞系的鉴定  26-29
    3.7 潜伏感染单克隆细胞系的简单应用  29-31
  4、讨论  31-33
  参考文献  33-35
第二部分  35-60
  1、前言  35-37
  2、材料与方法  37-45
  3、结果  45-55
    3.1 人脐带血CD34~+HPCs的纯化、鉴定及培养  45-47
    3.2 HIV-1假病毒的制备和滴度检测  47-49
    3.3 HIV-1假病毒在CD34~+HPCs中的感染实验  49-52
    3.4 HIV-1感染人脐带血CD34~+HPCs可能性的机制探讨  52-55
  4、讨论  55-58
  参考文献  58-60
论文综述  60-72
  参考文献  68-72
致谢  72-73

HIV-1潜伏的人Jurkat T细胞模型的建立及中国流行株HIV-1 B/C重组亚型感染人脐带血造血祖细胞的研究

内容摘要

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