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三邻甲苯基磷酸酯抑制人成神经瘤SH-SY5Y细胞分化的自噬机制研究

作　者: 呼丹
导　师: 龙鼎新
学　校: 南华大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: TOCP 自噬 抑制分化 真核表达载体 转染
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）对人成神经瘤细胞SH-SY5Y细胞分化的影响，毒性作用与自噬的关系以及自噬水平的改变，为拓宽对TOCP的神经毒性机制的认识，进一步理解和揭示神经退行性病变的机理提供依据。方法：1.选用人成神经瘤细胞SH-SY5Y为细胞模型，MTT法检测TOCP对SH-SY5Y细胞增殖的影响，以全反式维甲酸（ATRA）为诱导分化工具药物，三甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬抑制剂，在分化诱导过程中以及诱导分化后以不同浓度TOCP（0-1.0mmol/L）作用，动态观察SH-SY5Y细胞形态学变化，测量细胞突起长度，统计已分化细胞所占比例，台盼蓝拒染法检测死亡细胞百分比。2.在不同浓度TOCP（0-1.0mmol/L）处理后，采用自噬小体特异染色剂单丹尸磺酰胺（MDC）对细胞进行染色观察拍照后裂解，应用荧光分光光度计（激发光波长380nm、发射光波长525nm）测定荧光强度进行定量分析。3.用脂质体转染GFP-LC3质粒至SH-SY5Y细胞，用ATRA进行诱导分化3天，1.0mmol/LTOCP处理SH-SY5Y细胞24h后，用间接免疫荧光法检测神经纤维NF-H与自噬泡是否融合。4. TOCP（0-1.0mmol/L）处理SH-SY5Y细胞48h后，提取细胞总蛋白进行定量，采用蛋白免疫印迹法检测神经纤维NF-H以及自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达。结果：1. TOCP处理48h或72h，细胞增殖则受到明显的抑制，呈一定的浓度依赖关系，48h和72h的半数抑制浓度（IC50）分别为0.77mmol/L和0.07mmol/L。ATRA对SH-SY5Y细胞作用7天可导致细胞出现长出较长突起的分化特征，在诱导分化过程中及诱导分化后以不同剂量TOCP作用于细胞，各剂量组与对照组相比，无论是突起长度还是分化细胞比例均有显著性差异（P<0.05），并呈一定的时间剂量依赖关系；其中，0.6mmol/L组抑制效果最强在抑制自噬后，细胞突起和细胞分化百分比有差异，提示TOCP抑制细胞突起生长可能与自噬有关2.在荧光倒置显微镜观察下，SH-SY5Y细胞的荧光颗粒(染色的自噬小体)明显比正常对照组增多，且随着TOCP浓度的增高，荧光颗粒越多，着色也随之加深，与正常对照组比较，各剂量组细胞MDC染色后荧光分光光度计下检测的吸光度值(反映自噬水平)明显升高，并呈一定的剂量依赖关系。3. GFP-LC3质粒转染SH-SY5Y细胞后能在细胞中表达，荧光倒置显微镜观察下发出明亮绿色荧光，TOCP处理后间接免疫荧光检测结果显示绿色自噬泡与红色荧光标记的神经纤维NF-H出现融合。4.随着TOCP浓度的增高，神经纤维NF-H发生降解，表达下降，自噬水平发生改变，自噬相关蛋白Beclin-1表达增强，LC-3Ⅰ/LC-3Ⅱ值逐渐降低。结论：1. TOCP可抑制SH-SY5Y细胞的增殖与分化，并呈现一定时间和剂量依赖关系。2. TOCP可诱导SH-SY5Y细胞发生自噬，且呈剂量依赖关系。3. TOCP可导致SH-SY5Y细胞骨架蛋白NF-H的蛋白水平下降，可能与自噬有关。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-10
材料与方法  10-17
  1．材料  10-12
    1.1 细胞系及培养  10
    1.2 主要试剂  10-12
    1.3 主要仪器  12
  2. 实验方法  12-17
    2.1 TOCP 对 SH-SY5Y 细胞的增殖影响  12-13
    2.2 TOCP 对 SH-SY5Y 细胞形态分化的影响  13-14
    2.3 TOCP 对 SH-SY5Y 细胞自噬水平的影响  14
    2.4 细胞骨架蛋白降解方式分析  14-15
    2.5 TOCP 对自噬相关蛋白表达的影响  15-17
结果  17-26
  1．TOCP 对 SH-SY5Y 细胞分化的影响  17-21
    1.1 TOCP 对 SH-SY5Y 细胞增殖的影响  17
    1.2 ATRA 诱导 SH-SY5Y 细胞的形态学改变  17-18
    1.3 TOCP 对诱导中 SH-SY5Y 细胞分化的影响  18-20
    1.4 TOCP 对已分化细胞的影响  20-21
  2.TOCP 对 SH-SY5Y 细胞自噬水平的影响  21-22
    2.1 TOCP 导致 SH-SY5Y 细胞中自噬泡的增加  21-22
    2.2 SH-SY5Y 细胞 MDC 染色法后 OD 值比较  22
  3．骨架蛋白 NH-F 降解方式检测  22-24
  4．TOCP 处理对自噬相关蛋白表达的影响  24-26
讨论  26-33
结论  33-34
参考文献  34-39
附录 1  39-44
附录 2 综述  44-56
  参考文献  52-56
附录 3  56-57
致谢  57

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 神经系肿瘤
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