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鸡Toll样受体1/2基因的克隆、表达及功能的初步研究

作　者: 陈浩
导　师: 韦平
学　校: 广西大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡Toll样受体2家族 稳定转染 真核表达 细胞系 配体识别
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 38次
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内容摘要


Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是先天免疫系统重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR),它属于Ⅰ型跨膜蛋白。这类受体在机体的先天免疫应答中具有识别入侵的病原微生物,引起机体炎症反应从而有助于清除病原的重要作用。目前已经识别了10种鸡的Toll样受体(chicken toll-like receptor, chTLRs)。本课题通过设计4对引物分别对chTLR2家族的4个成员1LA、1LB、2t1和2t2的含ORF全长基因序列进行扩增,并串联Lumio标签序列。将扩增基因片段克隆进真核表达载体pVITRO1-neo-mcs,通过PCR和双酶切鉴定,证实成功构建了pVITRO1-neo-mcs-chTLR1LA、1LA、2t1和2t2四个重组真核表达质粒。并将这些重组质粒单个和两两组合共10组分别稳定转染Vero细胞,通过RT-PCR、蛋白PAGE凝胶电泳(Lumio融合蛋白)对重组质粒的表达情况进行检测。检测结果显示,成功获得了能够稳定表达重组质粒的T1-T10 vero细胞系。将检测质粒pNiFty2-SEAP稳定转染T1-T10Vero细胞株,构建T1’-T10’Vero细胞系,分别以含10μg/mL的LPS和Zymosan的HEK-BlueTM Detection刺激T1’-T10’Vero细胞系,同时设定无刺激对照组、阴性对照组(vero细胞转染检测质粒)和空白对照组。刺激9h后观察颜色变化并测定其OD值。LPS刺激组中的T1’、T3’和T9’Vero细胞株,Zymosan刺激组中的T9’Vero细胞株,无刺激对照组中的T4’和T8’Vero细胞株的分泌型碱性磷酸酶浓度(SEAP)均与极显著高于阴性对照组(P<0.01)。本课题研究结果表明,在chTLR2家族对LPS识别过程中,可能需要chTLR1LA单体、chTLR2t1单体和chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；在chTLR2家族对Zymosan识别过程中,可能需要chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；而无刺激对照组的检测结果表明,chTLR2t2单体活化NF-κB的作用比实验中所采用的其它单体和复合物更强,说明chTLR2t2单体可能对某些病原具有配体识别功能。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
主要中英文对照表  8-9
目录  9-11
前言  11-12
第一章 Toll样受体概况  12-22
  1.1 鸡的Toll样受体  13-19
    1.1.1 禽类TLR1和TLR2亚家族及其作用模式  14-15
    1.1.2 禽类独特的TLR15及其效应  15-16
    1.1.3 脊椎动物保守的TLRs在禽类的分子进化及作用机制  16-18
    1.1.4 Toll样受体的应用前景  18-19
  1.2 脊椎动物TLR2亚家族结构与功能  19-21
    1.2.1 TLR2亚家族结构特点  19-20
    1.2.2 TLR2亚家族功能特点  20-21
  1.3 开展本课题研究的目的和意义  21-22
第二章 鸡Toll样受体1/2基因的克隆  22-28
  2.1 材料和方法  22-25
    2.1.1 材料处理  22
    2.1.2 主要试剂  22
    2.1.3 PBMC的核酸提取  22
    2.1.4 反转录合成cDNA  22
    2.1.5 引物设计和目的基因片段的扩增  22-25
  2.2 结果  25-26
    2.2.1 ChTLR1LA基因的PCR扩增结果  25
    2.2.2 ChTLR1LB基因的PCR扩增结果  25-26
    2.2.3 ChTLR2t1基因的PCR扩增结果  26
    2.2.4 ChTLR2t2基因的PCR扩增结果  26
  2.3 讨论  26-28
第三章:鸡Toll样受体1/2重组质粒的构建  28-37
  3.1 材料和方法  28-29
    3.1.1 菌株及载体  28
    3.1.2 主要试剂  28
    3.1.3 鉴定引物的设计与合成  28-29
  3.2 重组质粒的构建  29-32
    3.2.1 pVITRO1-neo-mes载体的酶切  29
    3.2.2 DH5α E.coli感受态细胞的制备  29-30
    3.2.3 插入的目的片段的双酶切  30
    3.2.4 重组质粒的连接、转化与鉴定  30-31
    3.2.5 重组质粒稳定转染前的准备  31-32
  3.3 结果  32-36
    3.3.1 重组质粒pVITRO1-neo-mes-chLR1LA的PCR鉴定  32-33
    3.3.2 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR1LB的PCR鉴定  33
    3.3.3 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR2t1的PCR鉴定  33-34
    3.3.4 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR2t2的PCR鉴定  34
    3.3.5 酶切鉴定  34-36
  3.4 讨论  36-37
第四章:鸡Toll样受体1/2重组质粒转染Vero细胞  37-47
  4.1 材料和方法  37-40
    4.1.1 细胞及载体  37
    4.1.2 主要试剂及配制  37-38
    4.1.3 重组真核表达质粒稳定转染Vero细胞  38-39
    4.1.4 G418对稳定转染重组质粒evro细胞的筛选  39
    4.1.5 转染后Vero细胞株的Toll样受体1/2的mRNA转录水平的检测  39-40
    4.1.6 转染后Vero细胞株的Toll样受体1/2表达水平的检测  40
  4.2 结果  40-45
    4.2.1 G418抗性筛选结果  40-42
    4.2.2 Vero细胞中chTLRs的mRNA转录水平的检测结果  42-44
    4.2.3 Vero细胞中重组质粒的蛋白表达的检测  44-45
  4.3 讨论  45-47
第五章 鸡的TLR1/2复合物的功能的初步研究  47-52
  5.1 材料和方法  47-48
    5.1.1 细胞、载体及试剂  47
    5.1.2 主要试剂配制  47
    5.1.3 检测质粒pNiFty2-SEAP的转染T1-T10 Vero细胞株  47
    5.1.4 LPS、Zymosan刺激T1’-T10’Vero细胞株浓度的确定  47-48
    5.1.5 HEK-Blue~(TM) Detection检测重组细胞表达的分泌型碱性磷酸酶活性  48
  5.2 结果  48-50
    5.2.1 G418和博来霉素Zeocin对重组细胞的筛选  48-49
    5.2.2 HEK-Blue~(TM) Detection检测结果  49-50
  5.3 讨论  50-52
第六章 结论  52-53
参考文献  53-57
附录  57-58
致谢  58-59
个人简历  59
攻读硕士学位期间所发表的学术论文及参与科研项目  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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