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肠道病毒71型导致中枢神经系统损伤的免疫机制研究

作　者: 巩勋
导　师: 金玉; 段招军
学　校: 兰州大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: EV71 细胞因子血浆脑脊液巨噬细胞模式识别受体
分类号: R725.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景：肠道病毒71型(EV71)是引起儿童手足口病的主要病原体之一,其感染可引发脑炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓炎等中枢神经系统病症,其中基于中枢神经系统病变而出现的肺水肿、肺出血是导致少数患儿死亡的主要原因。目前人们对EV71引发神经系统病变的发病机制尚不明确,本研究探讨了EV71感染患儿血浆、脑脊液中细胞因子表达与疾病严重程度的关系,分析了感染急性期和恢复期(甲泼尼龙、丙种球蛋白联合治疗7-14天后)脑脊液细胞因子的表达变化；同时通过比较脑脊液细胞因子的表达差异,评价了糖皮质激素和免疫球蛋白在EV71感染引发中枢神经系统病变中的治疗作用。实验设计：2010年4月到2011年9月,采集南京市儿童医院手足口病住院患儿血浆、脑脊液标本,通过PCR扩增方法确定感染病毒的类型；同期采集5岁以下健康体检儿童血样14例作为正常对照。本研究共检测确诊EV71感染的手足口病患儿血浆标本62例,其中普通型18例；重症33例；危重症11例(其中死亡5例)。脑脊液标本118例,其中手足口病并发脑炎、脑膜炎36例(急性期恢复期各18例)；并发脊髓炎20例(急性期恢复期各10例)；并发脑干脑炎28例(急性期恢复期各14例)；并发神经性肺水肿6例(仅急性期,其中死亡2例)。EV71型脑炎经糖皮质激素(甲泼尼龙)治疗48h患儿脑脊液样本12例,EV71型脑炎经丙种单球蛋白治疗48h患儿脑脊液样本16例。采用流式液相多重蛋白定量技术(Cytometric Beads Array-CBA)检测血浆、脑脊液细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10,IFN-a,IFN-y,IP-10,IL-8,RANTES,MCP-1,MIG等)表达变化。结果：EV71感染的重症、危重症患儿血浆中IL-1p,IL-6的浓度显著高于正常对照组；危重症患儿血浆IL-6和IL-8的浓度显著高于重症病例组和普通型手足口病。经配对t检验分析,EV71感染引发的脑炎、脑干脑炎和脊髓炎各组,脑脊液IL-6,IP-10,IL-8,MIG和(或)IL-1β的表达,恢复期较急性期显著下降；EV71感染的神经性肺水肿或脑干脑炎患儿急性期脑脊液IL-6,IL-8,IFN-y和(或)IL-1p,IP-10的表达显著高于普通脑炎患儿和脊髓炎患儿。另外,患儿血浆、脑脊液中TNF-α,IL-10,IFN-α,RANTES,MCP-1的浓度,在各组间均无明显的统计差异。经糖皮质激素治疗48h后,脑炎患儿脑脊液IP-10、IL-8的浓度较脑炎急性期和免疫球蛋白治疗组显著降低；IL-6的浓度较脑炎急性期和免疫球蛋白治疗组有降低趋势,但差异无统计学意义；EV71感染脑炎患儿经免疫球蛋白治疗48h后,脑脊液细胞因子的表达与脑炎急性期相比,无明显差别。结论：中枢神经系统是EV71感染引起炎症反应的主要部位,脑脊液细胞因子的表达水平与疾病的严重程度正相关,通过对脑脊液IL-1β,IL-6,IL-8,IFN-γ等的检测,可以预测疾病的发展进程。EV71感染患儿中枢神经系统炎症反应持续加重,可导致系统性炎症反应,从而引发危重症的出现。检测血浆中IL-6,IL-8的浓度水平,能对EV71感染的神经性肺水肿等危重症的出现起很好预警作用。糖皮质激素可能通过抑制IP10等炎症因子的表达,对并发中枢神经系统病变的EV71感染治疗有效。背景：模式识别受体(PRRs)能通过识别病原相关分子模式(PAMPs)诱导非特异性免疫应答。Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)和NOD样受体(NLRs)是目前发现的PPRs的三个主要家族。在病毒感染时,他们通过识别病毒的RNA或DNA结构,激活细胞产生Ⅰ型干扰素、前炎症因子和趋化因子等对抗病毒感染。在并发中枢神经系统病变的EV71感染过程中,患儿血浆、脑脊液样本中均发现细胞因子的显著增高,然而对细胞因子产生的信号机制尚不明确。本研究调查了EV71感染患儿血液单核细胞TLRs、RLRs和NLRs等受体的基因表达情况,为研究EV71感染引起细胞因子增高的信号机制奠定基础。实验设计：采集EV71感染的手足口病及健康儿童外周血液样本,并分选出外周血单核细胞(PBMC),共检测标本77例,包括正常对照组14例；手足口病普通型18例；重症型34例；危重症型11例。采用Real-time PCR方法,检测外周血单核细胞TLRs、RLRs和NLRs等受体mRNA的表达情况。结果：EV71感染的手足口病患儿(包括手足口病普通病例、重症病例和危重症病例)外周血单核细胞TLR2、TLR4、TLR7、TLR8和Mda-5等受体1nRNA的表达较正常对照组显著升高,而感染各组之间差异不明显。EV71感染的重症、危重症病例,外周血单核细胞TLR3和RIG-Ⅰ受体mRNA的表达较正常对照组显著降低。此外,少数危重症患儿外周血单核细胞NLRP3受体mRNA的表达增高,但是危重症与其他各组相比,无统计差异。EV71感染各组与正常对照组相比,TLR1、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10、NLRX1、NLRC5和NLRP1等模式识别受体的基因变化无明显差异。结论：EV71感染后,能激活TLR2等多种模式识别受体,并可能参与了病毒感染引发的细胞因子高表达,及其诱导的炎症反应,但是这些受体的基因表达水平与疾病的严重程度关系不大。EV71病毒能抑制TLR3,RIG-I等受体的基因转录,其详细机制需要进一步研究。背景：感染患儿血浆、脑脊液中前炎症因子和趋化因子的表达水平,与疾病的临床严重程度密切相关,被认为是病情发展进程的良好预警指标,然而人们对细胞因子的细胞来源和信号机制尚不明确。本研究采用EV71病毒感染人类原代培养的巨噬细胞,分析了病毒感染、复制情况及巨噬细胞的功能变化,并探讨了其可能的信号机制。实验设计：体外分选培养人单核细胞分化的巨噬细胞,并用EV71病毒进行感染,应用免疫荧光、western blot、Real-time RT-PCR等技术,分析病毒在巨噬细胞的感染复制情况。采用CBA方法检测细胞培养上清液中细胞因子(IL-1p,IL-6,TNF-α,IFN-α,IFN-γ,IP-10,IL-8,RANTES,MCP-1,MIG等)的表达情况,采用Real-time RT-PCR检测巨噬细胞中TLRs、RIG-I和MDA5的基因表达变化。结果：病毒能有效的感染人原代培养的巨噬细胞,并且能在巨噬细胞中复制和翻译蛋白。EV71病毒而不是UV灭活病毒在早期(12-h POI.)就能显著刺激细胞分泌TNF-α,但是培养上清中TNF-a的表达水平随时间而逐渐降低。EV71病毒能诱导巨噬细胞分泌IL-1β和IL-6,但不能诱导IFN-α和IFN-γ的产生。不仅有活性的EV71病毒能刺激趋化因子IL-8, RANTES和IP-10的高表达,UV灭活病毒也能有效的刺激巨噬细胞分泌IL-8。此外,EV71能激活巨噬细胞TLR2,TLR7和TLR8mRNA的表达活化,对其他模式识别受体的基因表达影响不大。结论：本研究首次证实了EV71能感染人类原代培养的巨噬细胞,并且能在巨噬细胞中进行复制。巨噬细胞不仅是EV71攻击的靶细胞,也是重要的效应细胞,在EV71病毒的刺激下,巨噬细胞能分泌大量细胞因子对抗病毒感染。然而巨噬细胞的过度活化,可能会导致炎症反应的增强和病毒的扩散,从而对机体产生不利影响。我们研究结果提示,巨噬细胞可能在EV71感染引发的中枢神经系统病变中发挥重要作用。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-13
第一部分 EV71感染患儿细胞因子检测  13-38
  前言  13-16
  材料与方法  16-23
    1 研究对象及样本采集  16
      1.1 研究对象  16
      1.2 样本采集  16
    2 实验材料  16-17
      2.1 试剂  16-17
      2.2 仪器和设备  17
    3 引物  17-18
    4 实验方法和步骤  18-22
      4.1 通过PCR扩增EV71片段进行标本的复核  18-20
      4.2 血浆细胞因子检测  20-22
    5 统计分析  22-23
  结果  23-32
    1 血浆样本研究结果  23-27
      1.1 一般情况  23
      1.2 实验室检查  23-24
      1.3 细胞因子表达变化  24-27
    2 脑脊液研究结果  27-32
      2.1 一般情况及实验室检查  27
      2.2 前炎症因子及抑炎因子表达变化  27-28
      2.3 趋化因子表达变化  28-29
      2.4 干扰素表达变化  29-30
      2.5 激素或丙球治疗对细胞因子的影响  30-32
  讨论  32-38
第二部分 EV71感染患儿PRRs基因表达分析  38-55
  前言  38-40
  材料与方法  40-48
    1 研究对象及样本采集  40
      1.1 研究对象  40
      1.2 样本采集  40
    2 实验材料及仪器  40-41
      2.1 试剂  40-41
      2.2 主要溶液的配制  41
      2.3 仪器和设备  41
    3 实验方法和步骤  41-46
      3.1 PBMC的分选  41-42
      3.2 血液标本PBMCmRNA的提取  42-43
      3.3 mRNA反转录  43
      3.4 Real-time PCR标准品的制备  43-45
      3.5 Real-time PCR  45-46
    4 统计分析  46-48
  结果  48-51
    1 EV71感染患儿TLR1-10 mRNA表达变化  48-49
    2 EV71感染患儿RIG-Ⅰ,Mda-5 mRNA表达变化  49-50
    3 EV71感染患儿NLRs mRNA表达变化  50-51
  讨论  51-55
第三部分：EV71感染巨噬细胞的免疫应答反应  55-74
  前言  55-57
  材料与方法  57-66
    1 实验材料及仪器  57-58
      1.1 实验材料  57-58
      1.2 Western blot所需溶液的配制  58
      1.3 仪器和设备  58
    2 实验方法及步骤  58-65
      2.1 病毒的扩增及滴度的测定  58-60
      2.2 人类原代巨噬细胞的分选、培养  60-61
      2.3 EV71感染巨噬细胞  61-62
      2.4 EV71病毒复制的检测  62-64
      2.5 EV71感染巨噬细胞细胞因子检测  64-65
      2.6 EV71感染巨噬细胞PRRs mRNA表达的测定  65
    3 统计学分析  65-66
  结果  66-71
    1 EV71有效感染人原代培养巨噬细胞  66
    2. EV71在巨噬细胞中的复制  66-68
    3. EV71诱导前炎症因子而非干扰素分泌  68-69
    4. EV71诱导巨噬细胞分泌趋化因子  69
    5. EV71激活巨噬细胞TLRs的表达  69-71
  讨论  71-74
结论  74-75
附录中英文缩略词表  75-81
参考文献  81-87
致谢  87-88
论文发表  88

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