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神经肽P物质在高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用及其对SHH信号通路影响的研究
作 者: 杨林
导 师: 许峰
学 校: 重庆医科大学
专 业: 急诊医学
关键词: 高氧 肺损伤 肺泡Ⅱ型上皮细胞 神经肽SP L703.606 SHH信号通路
分类号: R722.6
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
背景氧疗是临床上治疗呼吸系统疾病的常用方法,但长时间高浓度氧,可产生大量的氧自由基,超过细胞的防御能力,从而引起炎症,细胞损伤,坏死和凋亡相关基因的过表达,从而致各种急性或慢性肺损伤。肺泡上皮细胞是高氧暴露后氧化损伤的主要靶点,其损伤后的修复主要依靠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的增殖、分化为肺泡I型上皮细胞(AECⅠ)。AECⅡ细胞的功能状态是决定肺损伤病理转归的主要因素。神经肽P物质(SP)广泛分布于气道上皮细胞层内,可启动早期的神经源性炎性反应,参与对损伤细胞的修复、增殖、迁移、分化调控。本课题组前期研究发现神经肽P物质能够降低高氧诱导的氧化损伤,但调节的分子机制尚不完全清楚。目的(1)早产鼠AECⅡ的体外分离、培养、纯化及鉴定,以及氧化损伤细胞模型的建立。(2)高氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的氧化损伤以及神经肽P物质(SP)对AECⅡ的保护作用。方法(1)原代分离培养孕19d早产鼠AECⅡ,随机分为4组:空气组、高氧组、高氧+SP组、高氧+SP+SP拮抗剂组。空气组和高氧组分别置于氧体积分数为0.21的空气和氧体积分数为0.95的氧气中暴露24h;高氧+SP组在置于空气或高氧环境前加入SP;高氧+SP+SP拮抗剂组同时加入SP和SP受体拮抗剂L703.606后,再置于氧体积分数为0.95的氧气中培养24h。(2)倒置相差显微镜及电镜下观察高氧暴露及神经肽P物质干预对AECⅡ细胞的形态变化。(3)DCFH-DA分子探针法检查细胞内ROS水平。(4)MTT法和Annexin-V和PI双染色法分别检测细胞存活率和凋亡率。结果与空气组比较,高氧组暴露24h,光镜和电镜观察AECⅡ出现明显的氧化损伤,活性氧水平明显增加,进一步检测可见细胞凋亡率明显增加,存活率明显降低。神经肽SP预处理后形态学观察可见细胞损伤明显减轻,其活性氧水平明显降低,凋亡率明显降低,存活率明显升高。然而,神经肽SP受体拮抗剂L703.606干预后上述的保护作用明显减弱,细胞氧化损伤较神经肽SP预处理组明显增加。结论高氧暴露24小时,可导致早产鼠AECⅡ发生氧化性损伤,诱导细胞凋亡。而神经肽SP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤,减少凋亡,促进细胞存活,对高氧损伤的AECⅡ起保护作用。背景SHH信号通路是一种重要的信号转导通路,在细胞损伤修复中有着重要的作用。SHH产生有生物学活性的N末端片段(Shh-N),与其受体Patched1(Ptch1)结合。通过Hedgehog信号复合物(Hedgehogsignaling complex)介导,使信号转录因子Gli进入细胞核内,进一步激活其下游信号分子,起到基因和蛋白调控作用。大量研究表明SHH信号通路在胚胎形成,组织修复,创伤愈合,肿瘤形成方面有重要作用。在鼠肺组织,研究发现Shh信号通路在肺的形态发生和器官形成中起着至关重要的作用。前一部分已经证实了神经肽SP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤,减少凋亡,促进细胞存活,对高氧损伤的AECⅡ起保护作用。然而SP降低氧化损伤的机制尚不明确,是否与调控Shh信号通路有关,目前研究甚少。本部分进一步研究SP干预对高氧暴露下AECⅡ的损伤的作用,及是否有SHH信号通路的参与及SHH信号通路的调控机制。目的(1)早产鼠AECⅡ的原代培养及氧化损伤细胞模型的建立。(2)研究高氧暴露及SP干预对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的SHH信号通路分子的活化情况,从而研究是否有SHH信号通路的参与及神经肽P物质(SP)干预对SHH信号通路的调控作用。方法(1)早产鼠AECⅡ的体外分离、培养、纯化及鉴定,以及氧化损伤细胞模型的建立。(2)荧光定量PCR检测高氧暴露及SP干预对AECⅡ中SHH信号通路分子Shh和Patched1(Ptch1)基因表达的影响。(3)Western-Blot检测高氧暴露及SP干预对AECⅡ中SHH信号通路分子Shh和Patched1(Ptch1)基因表达的影响。结果与空气组比较,高氧暴露24h后,AECⅡ内SHH信号通路分子shhmRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05),而Patched1mRNA和蛋白表达水平明显降低。SP干预后,可促进高氧组AECⅡ内Shh信号通路激活,高氧+SP组Shh和Patched1mRNA水平较单纯高氧组明显升高(P<0.05)。而L703.606干预后可明显逆转上述SP的作用。结论SHH信号通路参与了高氧诱导细胞凋亡的信号转导系统,介导了神经肽SP对细胞的信号转导过程,参与了对高氧诱导AECⅡ损伤的保护作用,其通路的各分子,执行了SHH信号途径的保护作用。
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全文目录
英汉缩略语名词对照 5-6 中文摘要 6-10 英文摘要 10-16 前言 16-19 第一部分 神经肽P物质在高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用 19-31 背景 19 1 材料与方法 19-22 2 实验结果 22-27 3 讨论 27-29 小结 29 参考文献 29-31 第二部分 神经肽P物质调控SHH信号通路在高氧肺损伤中的研究 31-40 背景 31 1 材料与方法 31-35 2 实验结果 35-38 3 讨论 38-39 小结 39 参考文献 39-40 结论 40-41 文献综述 41-51 参考文献 47-51 致谢 51-52 攻读学位期间文章发表和学术活动 52-53
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