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子痫前期是常见的人类妊娠期特有疾病,它属于妊娠期高血压疾病的一种,是以妊娠20周之后高血压(BP≥140/90mmHg),蛋白尿(尿蛋白≥0.3∥24h或随机尿蛋白+)为主要临床表现的一组症候群,其可引起严重的母儿并发症,是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一。子痫前期发病率在国外为5%-8%,在我国为9.4%,子痫前期属于多系统疾患,根据血压升高的程度,尿蛋白量以及其它子痫前期相关症状的严重程度可分为轻度和重度子痫前期,重度子痫前期孕妇病情更为危重,随时可能出现足以危及产妇及胎儿生命的各种紧急情况。子痫前期的发病机制尚未得到完全阐明,目前多数研究表明子痫前期的发病与多种因素相关,主要包括胎盘,免疫,血管,遗传因素等。胎盘是母胎接触面,临床观察发现妊娠结束胎盘娩出后,子痫前期的病情可得到迅速控制,所以不少学者认为,胎盘对子痫前期的发病至关重要。滋养细胞是胎盘的主要细胞类型,其生物学行为与肿瘤细胞相似,具有正常分化、增殖、凋亡、迁移和浸润的能力,是胚胎着床与胎盘形成的关键。滋养细胞的功能异常与子痫前期的发病密切相关。而体内细胞功能的改变,主要依靠信号传导通路传递分子信息来实现。Wnt信号传导通路是调控细胞生长发育和分化的关键信号传导途径之一,Wnt蛋白与膜受体相结合后将信号传至细胞内,导致细胞质内β-catenin(p-连环蛋白)的积聚并进入到细胞核内,与核转录因子相互作用,进而启动核内多种靶基因转录,从而调控细胞的分化、增殖、极性、迁移和癌变等特性。Wntl是Wnt经典通路的始动因子,在多种恶性肿瘤中高表达,通过启动Wnt/β-catenin经典通路来抑制细胞凋亡,促进细胞侵袭及血管生成等作用参与了肿瘤的形成。β-catenin是Wnt信号通路细胞内主要的效应器,起着细胞核内信号的开关作用。其在胞质中积累继而向胞核的转位,被认为是该信号通路被启动的标志。DKKl(Dickkopf-1)是一种分泌型糖蛋白,它可以抑制Wnt信号通路,抑制细胞增殖和侵袭,诱导凋亡。最近研究发现Wnt信号通路在滋养细胞分化及侵袭过程中起到了重要的作用。而该通路是否参与了子痫前期的发病过程,以及在子痫前期发病过程中的作用目前还鲜有报导。本研究通过检测重度子痫前期及正常孕妇妊娠晚期胎盘组织中Wntl, DKK1, β-catenin的表达,初步探讨Wnt信号传导通路在重度子痫前期发病过程中的作用。目的本次研究通过比较妊娠晚期重度子痫前期组和正常晚孕组胎盘组织中Wntl, DKK1, β-catenin mRNA及蛋白的表达的有无差异,免疫组化定位Wnt1,DKK-1与β-catenin在两组胎盘组织中的位置,初步探讨Wnt信号传导通路在重度子痫前期发病过程中的作用。材料和方法1研究对象选择2010年1月至2012年1月在郑州大学第三附属医院产科住院,临床确诊为重度子痫前期的患者的胎盘组织30例作为病例组(sPE组),重度子痫前期诊断标准参照人民卫生出版社出版的第七版《妇产科学》,同期选取行择期剖宫产的正常晚孕孕产妇的胎盘组织30例为对照组。两组孕产妇均为单活胎、剖宫产,既往均无高血压病,糖尿病,肾病,抗磷脂综合症,多囊卵巢综合症以及其它妊娠合并症病史。2方法经两组孕产妇知情同意,在胎盘娩出后15分钟内避开胎盘边缘及钙化、出血、坏死处,分别于其母体面3、6、9、12点处以及中心位置取5块胎盘全层组织,大小约2cm×2cm×1cm,用无菌滤纸反复吸净组织块上的血液,取下的胎盘组织一部分放入10%福尔马林溶液中固定备用(用于免疫组化研究),剩余的组织分装入无菌冻存管后迅速放入液氮罐内,然后置于-80℃冰箱冻存备用(用于mRNA及蛋白提取)。采用Real-time PCR, Western blot的技术,比较妊娠晚期重度子痫前期组和正常晚孕组胎盘组织中Wntl, β-catenin, DKK1mRNA及蛋白的表达的有无差异,免疫组化定位Wntl,DKK-1与P-catenin在正常晚孕和子痫晚孕胎盘组织中的位置。3统计学处理所得数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析。记量资料用x±s表示,两组组间符合正态分布的计量数据采用两独立样本的t检验,不符合正态分布的计量数据采用Mann-Whitney U检验。有序多分类数据采用秩和检验。计数资料用率表示,两组间比较采用X2检验。采用2-△△cT方法分析mRNA相对表达量的差异。检验水平为α=0.05。结果1重度子痫前期组和正常对照组孕产妇一般临床数据的比较重度子痫前期组及正常对照组产妇平均年龄分别为29.17±5.48岁,30.73±3.35岁,孕时BMI分别为29.50±3.87,29.06±3.68,两组产妇年龄及孕时BMI相比差异均无统计学意义(P>0.05)。重度子痫前期组和正常对照组孕妇的收缩压分别为154.20±12.92mmHg,112.37±9.02mmHg,两组舒张压分别为101.23±10.20mmHg,74.97±7.37mmHg,重度子痫前期组孕妇收缩压及舒张压均高于正常对照组,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。重度子痫前期组和正常对照组孕妇的平均孕周分别为为35.35±2.69周和38.19±1.76周,两组新生儿平均体重分别为2240.00±729.71g,3248.37±529.03g,重度子痫前期组产妇孕周及新生儿体重均低于正常对照组,两组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。(见表3.1)2重度子痫前期组与正常对照组晚孕期胎盘组织中Wntl, DKK1, P-catenin mRNA的表达2.1重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中WntlmRNA的表达两组孕产妇胎盘组织中均可检测到WntlmRNA的表达,重度子痫前期组WntlmRNA相对表达量为0.53±0.21,正常对照组为1.05±0.19,重度子痫前期组WntlmRNA表达水平低于正常对照组,两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(表3.2,图3.1,图3.2,图3.3)2.2重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中DKKlmRNA的表达两组孕产妇胎盘组织中均可检测到DKKlmRNA的表达,重度子痫前期组及正常对照组DKKlmRNA相对表达量分别为2.05±0.78,1.18±0.56,重度子痫前期组DKKlmRNA表达水平高于于正常对照组,重度子痫前期组与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。(见表3.3,图3.4,图3.5,图3.6)2.3重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中(3-catenin mRNA的表达两组孕产妇胎盘组织中均可检测到β-catenin mRNA的表达,重度子痫前期组β-catenin mRNA相对表达量为0.63±0.39,正常对照组为1.25±0.56,重度子痫前期组β-catenin mRNA表达水平低于正常对照组,两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表3.4,图3.7,图3.8,图3.9)3重度子痫前期组与正常对照组晚孕期胎盘组织中Wnt1,DKK1,β-catenin蛋白的表达定位Wnt1,DKKl及p-catenin蛋白主要表达在胎盘合体滋养层细胞上,此外其在侵入底蜕膜的绒毛膜外滋养层细胞(EVT)上也有表达。Wntl,DKK1及β-catenin蛋白在重度子痫前期组及正常对照组胎盘组织中均有表达。免疫组化结果显示,Wntl,β-catenin蛋白在重度子痫前期组胎盘组织中的染色强度明显低于正常对照组,而DKK1蛋白在重度子痫前期组胎盘组织中的染色强度明显高于正常对照组(P<0.05)。(见表3.5,3.6,3.7；图3.10,3.11,3.12,3.13,3.14)4重度子痫前期组与正常对照组晚孕期胎盘组织中Wntl, DKK1, P-catenin蛋白表达变化4.1重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中Wntl蛋白的表达Westernblot结果显示,重度子痫前期组胎盘组织中Wnt1蛋白的相对表达量为0.40±0.10,正常对照组为0.53±0.16,重度子痫前期组Wntl蛋白相对表达量低于正常对照组,两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。(见表3.8,图3.15)4.2重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中DKK1蛋白的表达重度子痫前期组胎盘组织中DKKl蛋白的相对表达量为0.33±0.17,正常对照组为0.20±0.05,重度子痫前期组DKK1蛋白相对表达量高于正常对照组,两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表3.9,图3.15)4.3重度子痫前期组与正常对照组胎盘组织中β-catenin蛋白的表达重度子痫前期组胎盘组织中β-catenin蛋白的相对表达量为0.39±0.11,正常对照组为0.53±0.14,重度子痫前期组β-catenin蛋白相对表达量低于正常对照组,两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。(见表3.10,图3.15)结论重度子痫前期患者胎盘组织中Wntl,β-catenin的表达量下降,DKK1表达量增加,提示Wnt信号传导通路可能参与到了子痫前期的发病过程中。
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