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骨髓间充质干细胞与脂肪源性干细胞治疗大鼠脊髓损伤的抗凋亡作用

作　者: 丁春劲
导　师: 杨惠林
学　校: 苏州大学
专　业: 骨外科
关键词: 大鼠骨髓间充质干细胞脂肪源性干细胞脊髓损伤抗凋亡
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

一、脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞的培养和鉴定目的：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）和脂肪源性干细胞（rADSCs），通过形态学、表面标记物和成骨、成脂及成神经诱导分化鉴定，为后续实验提供充足的细胞来源。方法：采用反复贴壁培养法分离培养rBMSCs， I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养rADSCs，通过流式细胞仪（FCM）以CD29、CD34和CD90表面标记物鉴定rBMSCs，以CD29、CD34、CD45和CD90表面标记物鉴定rADSCs，并分别进行成骨、成脂、成神经诱导分化，成骨诱导以碱性磷酸酶和Von Cassa染色鉴定，成脂肪细胞以油红染色进行鉴定，以NSE、MAP2免疫细胞化学染色鉴定成神经分化。结果：反复贴壁培养法分离培养的rBMSCs和I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养的rADSCs，经3代培养后细胞增殖速度都较好，形态较为均一。表面标记物检测显示rBMSCs阳性表达CD29和CD90，阴性表达CD34。rADSCs阳性表达CD90和CD29，阴性表达CD34和CD45。rBMSCs和rADSCs分别经诱导分化后都出现成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞形态，经碱性磷酸酶、Von Cossa染色证实为成骨细胞，经油红染色证实为脂肪细胞，经NSE和MAP2免疫细胞化学染色鉴定证实为神经细胞。3代培养后细胞大量繁殖。结论：采用反复贴壁培养法分离培养rBMSCs和I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养rADSCs，经过3代培养后可获得相对纯化，细胞生长状态较好，通过诱导分化检测，表明两者都具有多向分化能力。二、脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响。目的：比较rBMSCs和rADSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的抗凋亡作用。方法：6周龄SD大鼠8只，用于rBMSCs和rADSCs的分离培养。成年SD大鼠96只，根据手术方式和移植物不同随机分为6（A～F）大组，每组16只，每组又按照处死时间不同分为两组，每个亚组8只，共12组：A1．PBS假手术14天组；A2．PBS假手术28天组；B1．PBS手术14天组；B2．PBS手术28天组；C1．rBMSCs假手术14天组；C2．rBMSCs假手术28天组；D1. rBMSCs手术14天组；D2. rBMSCs手术28天组；E1.rADSCs假手术14天组；E2. rADSCs假手术28天组；F1. rADSCs手术14天组；F2.rADSCs手术28天组。各模型组均以改良Allen法制造大鼠下胸段脊髓损伤模型，假手术组仅咬除相应节段棘突及椎板，不干预脊髓。造模后7天，于腰椎水平(L4/L5间隙)蛛网膜下腔向各组注射相应移植物。观察各组动物造模前后及移植前后后肢运动功能，以BBB评分对其进行评估。按组别相应于移植术后第14天、第28天处死大鼠，灌注后以损伤节段或相应节段为中心取脊髓组织，石蜡包埋后行HE染色，原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(d-UTP)缺口末端标记技术(TUNEL)染色观察。结果：12组大鼠在造模前BBB评分均为21分(满分)。术后麻醉苏醒后，假手术组（A1、A2、C1、C2、E1、E2）大鼠BBB评分恢复到21分。手术组（B1、B2、D1、D2、F1、F2）大鼠造模术后第3天和第7天BBB评分均低于假手术组，有统计学意义(P<0．05)。rBMSCs移植治疗后，rBMSCs手术组（E1、E2）大鼠BBB评分持续增加，高于PBS手术组（B1、B2）大鼠（P<0.05）。但仍低于rBMSCs假手术组（C1、C2），有统计学差异(P<0.05)。rADSCs移植治疗后，rADSCs手术组（F1、F2）大鼠BBB评分也持续增加，高于PBS手术组（B1、B2）大鼠（P<0.05），但仍低于rADSCs假手术组（D1、D2），具有统计学差异(P<0.05)。rBMSCs手术组（E1、E2）和rADSCs手术组（F1、F2）大鼠BBB评分无明显差异（P>0.05）。PBS假手术组（A1、A2）大鼠BBB评分无明显变化。从移植术后第7天开始，rBMSCs手术组和rADSCs手术组大鼠BBB评分均高于相对应假手术组，有统计学差异(P<0.05)。脊髓组织切片行HE染色结果：移植后14天、28天，假手术组（A1、A2、C1、C2、E1、E2）脊髓组织切片均正常。各手术组（B1、B2、D1、D2、F1、F2）脊髓组织切片均可见空洞形成，PBS手术组空洞形成更为明显。移植术后14天，PBS手术组（B1）TUNEL染色细胞数多于rBMSCs手术组（D1）和rADSCs手术组（F1），有统计学差异(P<0.05)。而rBMSCs手术组（D1）和rADSCs手术组（F1）组均高于相对应的假手术组，有显著性差异(P<0.05)。移植术后28天，各小组组TUNEL染色阳性细胞数均减少，PBS手术组（B2）仍然高于其他各组，但无显著性差异（P>0.05）。结论：移植rBMSCs和rADSCs均可改善脊髓损伤模型大鼠的后肢运动功能，可减少脊髓损伤后脊髓的细胞凋亡。两者间无明显差异，提示rBMSCs和rADSCs移植在治疗大鼠脊髓损伤时都具有潜在的抗凋亡作用。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-13
前言  13-15
参考文献  15-18
第一部分骨髓间充质干细胞和脂肪源性干细胞培养鉴定  18-43
  材料和方法  18-24
  结果  24-27
  讨论  27-29
  附图  29-39
  参考文献  39-43
第二部分骨髓间充质干细胞和脂肪源性干细胞移植对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响  43-66
  材料和方法  43-51
  结果  51-56
  讨论  56-58
  附图  58-62
  参考文献  62-66
综述  66-77
  参考文献  72-77
英文缩略词表  77-78
课题资助  78-79
攻读学位期间公开发表的论文  79-80
致谢  80-82

骨髓间充质干细胞与脂肪源性干细胞治疗大鼠脊髓损伤的抗凋亡作用

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