学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究

作　者: 汤欣
导　师: 顾晓松
学　校: 苏州大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 组织工程化神经移植物周围神经缺损肿瘤坏死因子-alpha 施万细胞髓鞘
分类号: R651.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 88次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

第一部分组织工程化神经的体外构建目的采用背根神经节（DRG）神经元、施万细胞与生物材料支架在体外共培养，构建成一种类似神经组织的组织工程化神经，从而为更好地模拟自体神经移植修复神经缺损提供新技术。方法1.取新生1d SD大鼠坐骨神经，通过反复植块法获取高纯度的施万细胞；2.施万细胞注入丝素蛋白神经移植物管腔内，于生物反应器中培养7d后，两端各植入胚胎14.5-16.5d SD大鼠L4-6DRGs；3.培养基中培养，建立施万细胞/背根神经节(DRG)共培养体系，体外构建组织工程化神经；4.免疫细胞化学染色观察施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w的情况；5.扫描电镜分别于共培养2w、3w和4w后，观察丝管内细胞生长情况；6.透射电镜观察共培养3w后，丝管内超微结构和髓鞘形成情况。结果1.建立了施万细胞/背根神经节(DRG)/丝素蛋白神经移植物共培养体系，体外成功构建组织工程化神经；2.免疫细胞化学染色观察施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养2w后，S100阳性施万细胞与NF阳性DRG神经突起沿着丝素纤维，呈条带状纵向平行生长；3.扫描电镜观察结果表明，施万细胞与DRG神经突起呈纵向平行生长，共培养4w后有类似基质样结构形成；4.透射电镜结果显示，施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物共培养3w后，有髓鞘的形成。结论采用施万细胞、DRG与丝素蛋白神经移植物体外联合培养，可构建成具有神经样结构的组织工程化神经。第二部分组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的研究目的采用形态学、生物化学和电生理学等方法，检测组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的功能效果，为进一步完善组织工程化神经的构建提供参考。方法1.将体外构建的组织工程化神经桥接修复大鼠坐骨神经10mm缺损；2.术后12w，检测再生神经干动作电位，并计算神经传导速度；3.术后4w，6w，8w，10w和12w，测量并计算坐骨神经功能指数；4.术后4w、12w，采用免疫组织化学方法观察再生神经干的生长情况；5.术后12w，透射电镜观察再生髓鞘的厚度和髓鞘的板层数；6.术后12w，测量并计算靶肌横截肌纤维面积和单位面积胶原纤维百分数。7.术后4w，Western blot检测再生神经干中细胞粘附分子N-cadherin和周围髓鞘蛋白22（PMP22）的表达。结果1.组织工程化神经修复大鼠坐骨神经10mm缺损，术后12周，组织工程化神经组（nTENG）坐骨神经干复合肌动作电位（CMAP）与阳性对照的自体神经组（Autograft）相比没有显著差异,均明显优于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。组织工程化神经组（nTENG）的神经传导速度（MCV）与自体神经组（Autograft）相比没有显著差异。2.术后12w，组织工程化神经组（nTENG）坐骨神经功能指数（SFI）与阳性对照的自体神经组（Autograft）相比无显著差异，均明显优于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。3.术后4w，免疫组织化学结果表明，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autograft）均有成束的再生神经纤维形成；术后12w,再生神经纤维数量显著增加。4.术后术后4w和12w，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autograft）再生髓鞘的厚度和髓鞘的板层数与对侧非手术侧的比率，均显著高于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。5.术后12w，组织工程化神经组（nTENG）与阳性对照的自体神经组（Autograft）的靶肌纤维的横截面积，显著高于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）；而胶原纤维占肌纤维的百分率，均显著低于丝素导管组(Scaffold)（P<0.05）。6.术后4w，组织工程化神经组（nTENG）与自体神经组（Autograft）N-cadherin的表达水平显著高于丝素导管组（P<0.05）；而PMP22的表达水平从2w开始显著高于丝素导管组（P<0.01）。结论1.组织工程化神经修复大鼠坐骨神经10mm缺损，复合肌动作电位、运动神经传导速度、髓鞘厚度和板层数等功能指标均优于丝素导管组，与自体神经组无显著差异，组织工程化神经修复周围神经缺损明显促进损伤神经功能的恢复；2.组织工程化神经修复大鼠坐骨神经10mm缺损，可以促进再生和髓鞘形成等相关因子的表达。第三部分周围神经损伤后近端神经的基因表达和核心调控因子分析目的采用基因芯片技术检测坐骨神经损伤后差异基因的表达，通过Signal-flow方法，寻找周围神经损伤后近端神经损伤应答相关的核心调控因子，为优化组织工程化神经提供理论依据。方法1.采用随机方差模型（RVM），系统性分析大鼠坐骨神经横断后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h近端神经表达谱芯片，分析显著性差异表达基因；2.对差异基因进行表达趋势STC的显著性分析，得到显著性的表达趋势和趋势的所属基因；3.对主流表达趋势所包含的基因进行功能显著性分析和Pathway分类，得出主流趋势的基因最显著、靶向的功能和参与的显著性的Pathway；4.根据差异基因参与的显著性Pathway，利用数据库中的基因间的调控关系与基因的表达情况，定量化研究不同时间序列下的基因间的信号调控网络Signal-Flow。从而发现对整个基因表达变化影响最显著的核心调控因子；5.结合实验验证(1) qRT-PCR验证芯片结果；(2) Western blot/免疫荧光检测不同时间点重要候选因子的表达和定位；(3)原代培养施万细胞，采用基因干预、western blot等方法进行相关功能的验证；(4)关键核心调控因子的信号通路研究。结果1.大鼠坐骨神经离断后0h,0.5h,1h,3h,6h和9h后，采用随机方差模型(RVM)进行差异基因(mRNA)的筛选，共有2850个显著性差异表达基因(P<0.01)；2.基于KEGG数据库，对差异基因利用Fisher精确检验和χ2检验（Pvalue<0.001），共得到9个Pathway参与坐骨神经损伤早期反应，分别与细胞因子的相互作用、细胞黏附、TLRs信号途径、细胞凋亡等相关；3. Signal-Flow分析表明，抗凋亡因子、紧密连接因子、细胞极性和细胞黏附分子等，构成整个信号传递调控网络的核心成分，与炎症因子TNF-α信号通路相关的抗凋亡分子Birc2, Birc3和Tnfrsfla等在整个网络中显示较大的权重；4. ELISA检测坐骨神经损伤后，TNF-α炎症因子在0h,0.5h,1h,3h,6h,9h和12h表达升高；Birc2, Birc3和Tnfrsfla的表达也相应升高；5.免疫组化结果显示，Birc2, Birc3和Tnfrsfla与坐骨神经S100阳性细胞共定位，表明施万细胞Birc2, Birc3和Tnfrsfla参与炎症因子介导的抗凋亡；6.浓度为40ng/ml的TNF-α处理原代培养的施万细胞12h或者浓度为10ng/ml或20ng/ml TNF-α作用24h，均能显著上调凋亡因子cleaved-caspase3的表达；7. Birc2、Birc3或Tnfrsfla SiRNA干扰施万细胞，48h和72h后，流式细胞和TUNEL结果表明，施万细胞的凋亡发生明显增加。48h时，对照组凋亡细胞数占总细胞数的的11.18%，Birc2-siRNA凋亡细胞数为25.87%(P<0.05)，Birc3-siRNA凋亡细胞数为28.94%(P<0.05)，Tnfrsf1a-siRNA组为28.64%(P<0.01)；而在72h时，对照组凋亡细胞数占总细胞数的的16.91%，Birc2-siRNA凋亡细胞数为32.23%(P<0.01)，Birc3-siRNA凋亡细胞数为36.01%(P<0.01)，Tnfrsf1a-siRNA组则达到37.52%(P<0.01)；8.干扰了Birc2, Birc3和Tnfrsfla的48h和72h后，凋亡相关因子cleaved-caspase3和caspase6的表达均明显增加(P<0.05)；9. EdU染色检测不同浓度(0,2,5,10,20,40ng/ml)的TNF-α对原代培养施万细胞增殖的影响，结果表明，低浓度的TNF-α（≤2ng/ml）能促进施万细胞增殖(P<0.05)；而高浓度的TNF-α（≥10ng/ml）则明显抑制增殖(P<0.01)；TNF-α抑制剂能明显降低TNF-α的浓度效应；10. Transwell结果表明，高浓度的TNF-α（≥10ng/ml）能明显抑制原代培养施万细胞的迁移；11.形态学和生化检测发现，高浓度的TNF-α（≥10ng/ml）能诱发施万细胞的凋亡。透射电镜显示，用10、20或40ng/ml TNF-α处理后的施万细胞明显发生核固缩、细胞质出现空泡、以及凋亡小体的形成等典型的凋亡形态学的改变；施万细胞caspase-7, caspase-8和caspase-9表达与阴性对照组相比，显著增加；Annexin Ⅴ染色结果显示，TNF-α抑制剂能降低浓度为40ng/ml TNF-α处理后施万细胞的凋亡，且呈现剂量依赖的关系(P<0.01)；12. Co-IP结果显示FADD或RIP都可以与TRADD结合形成蛋白复合物，FADD与TRADD的相互作用随着TNF-α浓度的升高而增强(P<0.01)；与此相反，RIP与TRADD的相互作用随着TNF-α浓度的升高而降低(P<0.01)；13. Western blot检测发现p-JNK的表达量随着TNF-α处理浓度的升高而持续增加(P<0.01)；而p-NF-κB p65的表达量随着TNF-α浓度的升高显著降低(P<0.01)。结论1.周围神经损伤后，近端神经在短时间内对炎症反应作出应答，上调核心调控因子Birc2, Birc3和Tnfrsfla的表达，参与调控炎症因子TNF-α诱发的抗凋亡；施万细胞是关键的靶细胞；2.低浓度（≤2ng/ml）的炎症因子TNF-α能促进施万细胞增殖和迁移；而高浓度（≥10ng/ml）的TNF-α则诱发施万细胞的凋亡；3.低浓度（≤2ng/ml）的炎症因子TNF-α能促进RIP与TRADD的相互作用，抑制施万细胞的凋亡，而高浓度（≥10ng/ml）的TNF-α能促进FADD与TRADD的相互作用，增加施万细胞的凋亡；4.高浓度（≥10ng/ml）的TNF-α调节施万细胞的凋亡可通过caspase3、caspase6、caspase-7, caspase-8和caspase-9等途径。

全文目录

中文摘要  4-10
Abstract  10-18
前言  18-24
  参考文献  20-24
第一部分组织工程化神经的体外构建  24-35
  引言  24
  材料与方法  24-28
  结果  28-30
  讨论  30-31
  结论  31-32
  参考文献  32-35
第二部分组织工程化神经修复大鼠坐骨神经缺损的研究  35-51
  引言  35-36
  材料与方法  36-42
  结果  42-47
  讨论  47-48
  结论  48-49
  参考文献  49-51
第三部分周围神经损伤后近端神经的基因表达和核心调控因子分析  51-83
  引言  51-52
  材料与方法  52-63
  结果  63-75
  讨论  75-77
  结论  77-79
  参考文献  79-83
综述  83-123
  参考文献  99-123
英文缩略词表  123-126
攻读学位期间公开发表的论文  126
博士期间承担科研项目  126-127
学术交流情况  127-128
致谢  128-129

组织工程化神经的体外构建及其修复大鼠坐骨神经缺损的研究

内容摘要

全文目录

相似论文