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SSeCKS在施万细胞炎症反应中的作用

作　者: 陶涛
导　师: 季玉红；程纯；沈爱国
学　校: 南通大学
专　业: 免疫学
关键词: 施万细胞炎症 SSeCKS 分泌脱髓鞘大鼠
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的研究Src抑制的蛋白激酶C的底物(Src-suppressed protein kinase C substrate,SSeCKS)在炎症应激下的施万细胞中,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)自分泌、增殖抑制及髓鞘形成异常中的作用及其机制。方法1、为了研究SSeCKS在施万细胞TNF-α自分泌中的作用,本研究通过体外培养及纯化大鼠施万细胞,运用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测施万细胞TNF-α自分泌的能力,运用RT-PCR及蛋白免疫印迹检测TNF-α诱导SSeCKS的表达及p38与Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)信号转导通路的激活情况。在此基础上,构建SSeCKS干扰及过表达载体,转染施万细胞后,检测干扰及过表达SSeCKS后施万细胞TNF-α自分泌及p38与JNK信号转导通路激活的变化。2、为了研究SSeCKS在TNF-α诱导施万细胞的增殖抑制中的作用,本研究利用重组大鼠TNF-α处理施万细胞,运用5’-溴脱氧尿核苷(5’-bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法,分析施万细胞增殖的变化,利用RT-PCR及蛋白免疫印迹,检测TNF-α诱导SSeCKS的表达及磷酸化水平的变化。在此基础上,通过干扰大鼠施万细胞SSeCKS的表达,分析施万细胞增殖的改变。接着通过分析细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)的活性、cyclin D1的表达及其报告基因活性的改变明确SSeCKS对cyclin D1表达水平的调节及与ERK1/2激活的相关性;同时通过分析SSeCKS与cyclin D1结合能力及cyclin D1细胞亚定位的改变,明确SSeCKS对cyclin D1的定位的调节及其与两者结合能力的相关性。3、为了研究SSeCKS在施万细胞分化及髓鞘形成中的作用,本研究通过分离培养大鼠施万细胞及背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元,并在体外建立环单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)诱导施万细胞分化模型及施万细胞与DRG神经元体外共培养成髓鞘模型,分析施万细胞分化过程中SSeCKS的表达变化。在此基础上,干预SSeCKS的表达,分析其对施万细胞分化的形态学改变、分化相关标记物的表达及髓鞘形成能力的影响,并通过分析蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)的磷酸化水平,明确SSeCKS发挥上述作用的细胞信号机制。结果1、重组大鼠TNF-α刺激施万细胞24 h后,RT-PCR及ELISA分析发现施万细胞内TNF-α的mRNA水平及培养基中自分泌的TNF-α含量较未处理组显著增高,RT-PCR及蛋白免疫印迹也显示TNF-α处理后的施万细胞内SSeCKS的α亚型的mRNA及蛋白水平显著增加。干扰施万细胞中SSeCKS的表达发现,TNF-α诱导的自分泌量较未干扰组显著降低,过表达SSeCKS的α亚型后,施万细胞TNF-α诱导的自分泌显著提高。蛋白质免疫印迹显示,TNF-α可以激活p38和JNK信号通路,抑制p38及JNK可以有效地抑制TNF-α的自分泌。进一步的研究发现,干扰SSeCKS的α亚型的表达可以抑制TNF-α诱导的p38和JNK的激活,过表达施万细胞中的SSeCKS的α亚型后,TNF-α诱导的自分泌可以被p38和JNK的抑制剂SB202190和SP600125显著抑制。2、BrdU掺入法测定细胞增殖率发现用不同浓度的TNF-α处理施万细胞12 h后,细胞增殖率较正常组相比显著降低,在1 ng/ml被抑制50%,在10 ng/ml被抑制75%。流式细胞术显示,在予TNF-α处理后,72.2%的细胞被阻滞在G0/G1期,而在未处理的细胞中,仅有52.9%的细胞处于G0/G1期。RT-PCR及蛋白质免疫印迹显示在予TNF-α处理后,施万细胞内SSeCKS的α亚型的mRNA水平、蛋白水平及磷酸化水平较正常细胞以剂量依赖的方式增加。在予TNF-α处理SSeCKS的α亚型干扰的施万细胞,细胞增殖分析及流式细胞分析术发现降低SSeCKS的α亚型的表达可以逆转TNF-α诱导的施万细胞的增殖抑制及G0/G1期的阻滞。进一步分析其原因,发现cyclin D1的表达及ERK1/2的激活水平随着TNF-α的浓度增加而降低,干扰SSeCKS的α亚型表达可以逆转TNF-α诱导的cyclin D1的表达水平及ERK1/2的激活水平的降低。同时,TNF-α可以诱导施万细胞中cyclin D1的细胞核定位减少及cyclin D1与SSeCKS结合能力的增加,干扰SSeCKS的α亚型的表达可以逆转cyclin D1细胞核定位的减少。3、用cAMP诱导施万细胞体外分化中,SSeCKS的表达随着诱导的时间的延长而降低。用EGFP标记的SSeCKS siRNA的慢病毒载体干扰施万细胞中SSeCKS的表达可以加快体外诱导的细胞分化的形态改变,同时在SSeCKS表达干扰的施万细胞中,分化的标记髓鞘蛋白0(myelin protein zero,P0)及髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)的表达较未干扰组增加。将干扰SSeCKS表达的施万细胞与神经元共培养诱导髓鞘的形成,发现干扰了施万细胞中SSeCKS的表达可以促进体外形成髓鞘的数量。进一步分析其机制,发现干扰SSeCKS的表达可以促进Akt 473号位丝氨酸的磷酸化。结论1、施万细胞中存在着TNF-α的自分泌循环,其分泌的TNF-α可以作用于自身,诱导自身的JNK和p38信号转导通路的激活,促进TNF-α的合成和分泌;TNF-α作用于施万细胞后,表达增多的SSeCKS可以通过促进JNK和p38的激活,在TNF-α的自分泌循环中发挥着正向调控作用。2、TNF-α以剂量依赖的方式抑制施万细胞的增殖,诱导施万细胞中SSeCKS的mRNA水平、蛋白水平及磷酸化水平的上调,同时可以抑制cyclin D1的表达及细胞核定位。SSeCKS在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中发挥着负性调控作用。这主要是通过抑制ERK1/2激酶的活性,下调cyclin D1的表达及增加与cycling D1结合,抑制cyclin D1的细胞核转位发挥作用。3、SSeCKS在施万细胞的分化过程中表达下调,其可以抑制施万细胞的体外分化及髓鞘的形成;SSeCKS在施万细胞体外分化及髓鞘形成中的负性调控作用主要是通过抑制Akt的活化发挥作用。

全文目录

摘要  7-11
Abstract  11-14
第一章绪论  14-20
  1.1 课题来源、研究的目的和意义  14-15
  1.2 国内外研究概况  15-17
    1.2.1 国外研究概况  15-17
    1.2.2 国内研究概况  17
  1.3 本文的主要研究内容  17-18
  参考文献  18-20
第二章 SSeCKS 在施万细胞TNF-α自分泌中的作用  20-45
  第一节材料与方法  21-36
    1.1 实验动物及仪器设备  21-23
      1.1.1 实验动物  21
      1.1.2 主要仪器  21
      1.1.3 主要试剂  21-23
    1.2 实验流程与方法  23-36
      1.2.1 大鼠原代施万细胞的培养及纯化  23-24
      1.2.2 SSeCKS 基因的表达载体的构建与鉴定  24-28
      1.2.3 SSeCKS 基因的RNA 干扰载体的构建与鉴定  28
      1.2.4 ELISA  28-29
      1.2.5 逆转录多聚酶链反应  29-31
      1.2.6 Western Blot  31-32
      1.2.7 统计学处理  32
      1.2.8 试剂配制  32-36
  第二节结果  36-40
    2.1 SSeCKS 在施万细胞TNF-α自分泌中的作用  36-38
      2.1.1 SSeCKS 在施万细胞TNF-α自分泌中的表达变化  36-37
      2.1.2 SSeCKS 的α亚型促进施万细胞中TNF-α的自分泌  37-38
    2.2 SSeCKS 在TNF-α自分泌中的作用机制  38-40
      2.2.1 MAPK 通路在TNF-α自分泌中的作用  38
      2.2.2 SSeCKS 的α亚型在TNF-α诱导的MAPK 通路的激活中的  38-40
  第三节讨论  40-42
    3.1 MAPK 通路的激活在施万细胞TNF-α自分泌中的作用  40-41
    3.2 SSeCKS 在TNF-α自分泌中的作用  41-42
  第四节结论  42-43
  参考文献  43-45
第三章 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中的作用  45-65
  第一节材料与方法  46-53
    1.1 实验动物及仪器设备  46-47
      1.1.1 主要仪器  46
      1.1.2 主要试剂  46-47
    1.2 实验流程与方法  47-53
      1.2.1 BrdU 法测定细胞活力  47
      1.2.2 流式细胞仪分析细胞周期  47-48
      1.2.3 胞质、胞核蛋白质的提取  48
      1.2.4 免疫沉淀  48-49
      1.2.5 免疫荧光  49
      1.2.6 报告基因活性测定  49-51
      1.2.7 试剂配制  51-53
  第二节结果  53-60
    2.1 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中的表达变化  53-55
      2.1.1 TNF-α以剂量依赖的方式抑制施万细胞的增殖  53-54
      2.1.2 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中的表达变化  54-55
    2.2 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中的作用及机制  55-60
      2.2.1 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞增殖抑制中的作用  55-56
      2.2.2 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞cyclin D1 表达降低中的作用  56-57
      2.2.3 SSeCKS 在TNF-α诱导的施万细胞cyclin D1 定位变化中的作用  57-60
  第三节讨论  60-62
    3.1 SSeCKS 下调cyclin D1 的表达，抑制施万细胞的增殖  60
    3.2 SSeCKS 减少cyclin D1 的入核，抑制施万细胞的增殖  60-62
  第四节结论  62-63
  参考文献  63-65
第四章 SSeCKS 在施万细胞分化及周围神经髓鞘形成中的作用  65-80
  第一节材料与方法  66-70
    1.1 研究资料及仪器设备  66-67
      1.1.1 主要试剂  66-67
    1.2 实验流程与方法  67-70
      1.2.1 DRG 神经元的培养及体外诱导髓鞘的形成  67-68
      1.2.2 SSeCKS 基因RNA 干扰慢病毒载体的构建与鉴定  68-70
  第二节结果  70-75
    2.1 SSeCKS 在髓鞘形成中的表达变化及作用  70-73
      2.1.1 SSeCKS 在施万细胞分化中的表达变化  70-71
      2.1.2 SSeCKS 在cAMP 诱导施万细胞的形态变化中的作用  71-72
      2.1.3 SSeCKS在cAMP诱导施万细胞的髓鞘相关基因表达中的作用  72
      2.1.4 SSeCKS 在体外髓鞘的形成中的作用  72-73
    2.2 SSeCKS 抑制施万细胞分化及髓鞘的形成的机制  73-75
  第三节讨论  75-77
    3.1 cAMP 在施万细胞分化中的作用  75
    3.2 SSeCKS 对cAMP 诱导的施万细胞分化的调节及机制  75-77
  第四节结论  77-78
  参考文献  78-80
第五章总结  80-81
英文缩写词表  81-83
综述  83-94
  综述参考文献  90-94
在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目  94-96
致谢  96-99

SSeCKS在施万细胞炎症反应中的作用

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