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内质网应激上调SET7/9表达机制及其在糖尿病肾病中的作用

作　者: 陈吉刚
导　师: 冯兵
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 糖尿病肾病 内质网应激 SET7/9 XBP1s
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景和目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾病(ESRD)的重要原因。由于其发病机制尚未明确，缺乏有效的治疗手段。目前已经公认，糖尿病肾病是肾小球细胞炎症表型激活性疾病。因此揭示炎症激活的启动机制是遏制DN发生发展的重要措施。近年来研究表明，内质网应激(ERS)在糖尿病及糖尿病相关血管并发症发病中发挥重要作用。我们课题组在以前的研究中证实，ERS可通过调控氧化应激和炎症激活途径参与DN发病，应用分子伴侣4苯基丁酸干预内质网应激可降低ERS水平，减轻氧化应激及炎症激活，抑制DN的发展。此外，研究表明作为联系遗传和环境相互作用的枢纽，表观遗传修饰在DN的发病中也发挥重要作用。但内质网应激与表观遗传修饰之间是否存在调控联系目前尚不清楚。本研究拟利用db/db小鼠糖尿病肾病模型，通过甜菜碱调控ERS观察db/db小鼠肾组织ERS及相关转录因子变化规律，以及表观遗传修饰、炎症激活、肾脏病理、生化指标的变化情况。并利用RNAi实验进一步确认ERS调控SET7/9表达的具体机制，探讨ERS-SET7/9-MCP-1这一通路在DN发病机制中的作用。对象和方法1.利用DN小鼠模型证实ERS与SET7/9表达上调之间的关系1.1选取4周龄体质量20-26g的C57BL/KsJ背景db/db小鼠作为2型糖尿病肾病动物模型，按随机数字表法分为糖尿病肾病组(DN组)和甜菜碱治疗组(DN+B组)，以同周龄体质量14-16g的db/m小鼠为对照组(NC组)，每组18只，甜菜碱按800mg/kg·d的剂量每日予治疗组小鼠灌胃，DN组以等体积生理盐水代替。1.2在治疗开始后第4、8、12周末，分别随机从各组抽取6只小鼠。称量各组小鼠体重(BW)，留取24h尿液、血标本，采集双侧肾组织标本，应用过碘酸-希夫(PAS)染色观察db/db小鼠肾脏组织病理改变，并计算肾小球硬化指数(GSI)，半定量评估各组小鼠肾小球硬化程度。1.3用全自动生化分析仪检测各组小鼠各时相点血糖(BG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)含量。采用ELISA方法测定尿蛋白浓度及尿单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)含量，并计算24h尿蛋白排泄率(UPER)=24h总尿量(mL)×尿蛋白浓度(mg/L)。1.4应用实时荧光定量PCR法检测各时相点各组小鼠肾皮质GRP78、SET7/9、MCP-1的mRNA表达。1.5应用免疫印迹法(Western blot)检测各时相点各组小鼠肾皮质GRP78、ATF6α、SET7/9、XBP1s、H3K4me2的蛋白表达。1.6应用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测MCP-1启动子区H3K4me1、SET7/9的水平及SET7/9启动子区XBP1s的水平。2.利用RNAi方法进一步阐明DN形成过程中内质网应激上调SET7/9的机制2.1选取4周龄体质量20-26g的C57BL/KsJ背景db/db小鼠作为2型糖尿病肾病动物模型，按随机数字表法分为生理盐水组、control siRNA组，SET7/9siRNA组和XBP1siRNA组，每组6只。每10天1次给予各组小鼠尾静脉分别注射生理盐水（1ml）、control siRNA，SET7/9siRNA和XBP1siRNA（各50ug siRNA试剂稀释在1ml PSB溶液中），2个月后收集各组小鼠肾组织。2.2应用过碘酸-希夫(PAS)染色，光镜下观察各组小鼠肾脏组织病理改变，并计算肾小球硬化指数(GSI)，半定量评估各组小鼠肾小球硬化程度。2.3应用免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾皮质SET7/9、XBP1s的蛋白表达。2.4应用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测MCP-1启动子区SET7/9募集及H3K4me1水平。2.5应用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肾皮质SET7/9、XBP1s、MCP-1的mRNA水平。结果1利用DN小鼠模型证实ERS与SET7/9表达上调之间的关系1.1db/db小鼠肾脏病理动态改变及甜菜碱作用各时期NC组小鼠肾组织无明显异常。DN组小鼠第4周末时肾小球病理改变并不明显，第8周末逐渐出现肾小球基底膜增厚、系膜基质积聚等糖尿病肾病改变。12周时表现为肾小球系膜细胞明显增生、系膜基质大量积聚和基底膜增厚等典型的DN病理改变。而DN+B组较DN组肾脏改变明显减轻。第12周末时DN组小鼠的GSI(0.56±0.13)显著高于NC组(0.05±0.02)，DN+B组GSI(0.24±0.08)较DN组显著下降，肾脏病理改变显著减轻(P<0.05)。提示db/db小鼠随着鼠龄增加，DN不断进展，甜菜碱能有效抑制DN发展。1.2db.db小鼠BW、BG、Scr、BUN、UPER、MCP-1的动态变化及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠BW、BG、BUN、UPER和尿MCP-1排泄从实验第4周末开始显著升高，并呈时间依赖性增加。与DN组比较，DN+B组BW、BG、BUN、尿MCP-1明显降低，UPER自第8周末开始降低(均P<0.05)。各组肌酐比较无明显差异。提示db/db小鼠随着鼠龄增加，DN不断进展，甜菜碱能有效抑制DN发展。1.3db/db小鼠肾皮质GRP78、ATF6α、XBP1s的动态变化及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质GRP78mRNA的表达显著升高，DN+B组较DN组显著降低(均P<0.05)。DN组小鼠肾皮质GRP78、ATF6α、XBP1s的蛋白表达较NC组显著升高，而DN+B组小鼠肾皮质GRP78蛋白表达较DN组明显下降，ATF6α、XBP1s蛋白从第8周末开始也明显降低(均P<0.05)。提示，db/db小鼠肾脏ERS激活，并且进行性增强，而甜菜碱能显著下调ERS的强度。1.4db/db小鼠肾皮质MCP-1的动态改变及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质MCP-1mRNA的表达显著升高，DN+B组较DN组显著降低(均P<0.05)。提示，db/db小鼠肾脏炎症明显激活，而利用甜菜碱调控ERS能显著降低炎症水平。1.5db/db小鼠肾皮质SET7/9的动态改变及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质SET7/9mRNA的表达显著升高，DN+B组较DN组显著降低(均P<0.05)。DN组小鼠肾皮质SET7/9的蛋白水平较NC组显著升高，而DN+B组小鼠皮质SET7/9蛋白水平从第8周开始较DN组明显下降(均P<0.05)。提示，db/db小鼠肾脏SET7/9水平明显增加，而利用甜菜碱调控ERS能显著抑制其表达。1.6db/db小鼠肾皮质H3K4me2的动态改变及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质H3K4me2的蛋白水平明显升高，而DN+B组小鼠皮质H3K4me2蛋白水平从第8周开始较DN组明显下降(均P<0.05)。提示，db/db小鼠肾脏H3K4me2水平明显增加，而利用甜菜碱调控ERS能显著抑制H3K4me2水平。1.7db/db小鼠肾皮质MCP-1启动子区SET7/9募集、H3K4me1水平及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质MCP-1启动子区SET7/9募集及H3K4me1水平均明显增加，与DN组比较，DN+B组SET7/9募集及H3K4me1水平从第8周末开始明显下降(均P<0.05)。表明SET7/9介导的H3K4me1可能参与MCP-1的诱导，利用甜菜碱调控ERS能抑制SET7/9介导的H3K4me1的表达。1.8db/db小鼠肾皮质SET7/9启动子区XBP1s募集水平及甜菜碱的作用与NC组比较，DN组小鼠肾皮质SET7/9启动子区XBP1s募集水平明显增加，与DN组比较，DN+B组XBP1s募集水平从第8周末开始明显下降(均P<0.05)。表明XBP1s可能在SET7/9诱导中发挥重要作用。2利用RNAi方法进一步阐明DN形成过程中内质网应激上调SET7/9的机制2.1SET7/9或XBP1siRNA对db/db小鼠肾脏病理的影响与NC组比较，control siRNA组小鼠出现肾小球肥大，基底膜增厚，系膜基质积聚等糖尿病肾病改变，而SET7/9或XBP1siRNA组小鼠较control siRNA明显减轻(见图13)。表明抑制SET7/9或XBP1s的表达能明显改善db/db小鼠肾脏病理损害。2.2SET7/9siRNA对db/db小鼠肾皮质SET7/9、H3K4me1、MCP-1表达的影响与生理盐水组、control siRNA组比较，SET7/9siRNA组小鼠肾皮质SET7/9mRNA和蛋白表达均明显下降，MCP-1及MCP-1启动子区H3K4me1的表达水平也明显降低(均P<0.05)(见图14-17)。这些结果表明SET7/9-H3K4me1在MCP-1的诱导中发挥重要作用。2.3XBP1siRNA对db/db小鼠肾皮质XBP1s、SET7/9、SET7/9募集、H3K4me1、MCP-1表达的影响与生理盐水组、control siRNA组比较，XBP1siRNA组小鼠肾皮质XBP1s mRNA和蛋白的表达均明显下降，SET7/9mRNA表达也随之降低，MCP-1及MCP-1启动子区SET7/9募集、H3K4me1的水平均明显降低(均P<0.05)(见图18-23)。表明XBP1s在SET7/9-H3K4me1介导的MCP-1表达中发挥重要作用。结论1ERS通过偶联的转录因子XBP1s上调SET7/9表达而参与DN的发病。2通过调控XBP1s及SET7/9表达能有效控制DN的进展。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病性昏迷及其他并发症
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