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AngⅡ、ET-1及HIF-1α在糖尿病肾病肾间质纤维化中的作用及干预研究

作　者: 张翠翠
导　师: 唐琳
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 糖尿病肾病肾间质纤维化血管紧张素Ⅱ 内皮素-1 缺氧诱导因子-1α
分类号: R692.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus, DM)发病率最高且危害最大的慢性微血管并发症之一,现今国际范围内终末期肾脏疾病(End stage renal disease, ESRD)的首要病因即为DN,约有40%的1型DM患者和5%-10%的2型DM患者会出现DN。DM可经由各种不同途径累及肾脏的所有解剖结构(肾小球、肾小管、肾间质和肾脏血管等)。近期大量研究表明,在各种原发及继发肾小球疾病中,肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis, RIF)程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。又有研究提示,RIF的程度与肾功能减退的相关性比肾小球硬化与肾功能减退的相关性更为密切。多种慢性肾脏疾病发展至ESRD均会经过RIF这个共同的通路。两种重要的血管活性激素血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)和内皮素1 (Endothelin-1, ET-1)均可由肾小管上皮细胞分泌,DN时,随着AngⅡ及ET-1活性的增加,细胞增生、肥大,细胞外基质(Extracellular matrixc, ECM)的降解受到抑制,同时ECM的合成增加,AngⅡ及ET-1还能够介导炎症反应,参与并加速RIF的进程。慢性缺血、缺氧普遍存在于糖尿病肾病的RIF进程中,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-la, HIF-la)是组织缺血、缺氧时表达增多的标志性产物；AngⅡ活性增加的同时,可刺激HIF-1α在肾小管上皮细胞的表达增高；HIF-1α亦是ET-1的上游基因,对其合成及分泌有调控作用,AngⅡ及ET-1间还存在交叉作用,AngⅡ能够使内皮素转化酶的活性增加,进一步使前内皮素原mRNA转录活性增加,最终使ET-1合成增多。ET-1能增加血管紧张素转换酶的活性,从而促进血管紧张素Ⅰ向AngⅡ的转化,另外一方面,二者效应的发挥还可通过二者之间存在的共用受体实现。总之,AngⅡ、ET-1及HIF-1α相互之间存在紧密联系。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(Angiotensin receptor blockers, ARBs)在慢性肾脏病治疗方面,有着不可忽视的作用,ARBs可明显减少蛋白尿,且不依赖于血压的控制,并能有效减少血压正常的DM患者的尿蛋白排泄率,从而减少长期蛋白尿对肾小球造成的损伤作用。近期随着肾小管间质在DN发生发展中的作用日益得到重视,ARBs对肾小管间质的保护作用也逐渐受到关注。ARBs对ATI受体具有高度选择性,能完全阻断AngⅡ,从而对HIF-la及ET-1二者之间也产生一定的阻断作用,三者的生成减少,使肾小管间质纤维化的进展延缓,血管紧张素原(Angiotensinogen, AGT)为AngⅡ的前体,AngⅡ的生成受阻必然会反馈抑制AGT的合成。目前,有关AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN肾间质纤维化中的表达情况及三者间的相互作用研究较少。故本研究拟从DN大鼠的模型和DN患者两个层面,观察糖尿病肾病肾组织的RIF程度；并测定AngⅡ、ET-1及HIF-la的表达水平,以及三者与肾脏损害程度的关系；并用缬沙坦干预治疗,观察缬沙坦对AngⅡ、ET-1及HIF-1α的影响。旨在从Ang1Ⅱ、ET-1及HIF-1α角度,探讨糖尿病肾病RIF发生发展的相关机制,寻找预防和治疗DN的新方法。方法：(一)动物实验部分选取雄性SD大鼠54只,随机分成三组,即正常对照组(C组,n=18)、糖尿病模型组(D组,n=18)和缬沙坦治疗组(T组,n=18),禁食12小时,D组、T组大鼠采用一次性单侧腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ) 60mg/kg,以制备糖尿病大鼠模型,C组动物注射相同体积的生理盐水。稳定72小时后,剪尾法采尾静脉血测定血糖,若血糖大于16.7mmol/L,为DM模型动物造模成功。普通饮食继续喂养3周,用金属代谢笼收集24小时尿液后,测定24小时尿总蛋白排泄量,当24小时尿蛋白定量≥30mg时,确认DN大鼠模型成功。造模后T组大鼠给予缬沙坦混悬液按40mg/kg/d一次性灌胃,C组和D组大鼠给予同等体积蒸馏水灌胃,分别于4周末、8周末及12周末时随机选取6只大鼠,收集24小时尿液标本进行尿总蛋白定量；称体重、腹主动脉抽血测血糖、血肌酐、血浆白蛋白；肾脏称重,肾组织进行石蜡切片,Masson染色观察肾小管间质损害及纤维化；免疫组织化学法(即用型二步法)检测AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN大鼠肾小管间质中的表达；RT-PCR测定AGT、ET-1及HIF-1αmRNA的表达。(二)临床实验部分收集郑州大学第一附属医院肾内科2008年1月至2010年6月经临床和病理确诊的DN患者肾组织石蜡标本共47例(男20例,女27例),年龄(29-70)岁；健康对照组6例(男3例,女3例),取自发生意外而切除的健康肾组织。采用免疫组化检测方法(即用型二步法),检测AngⅡ、ET-1及HIF-la在DN患者及健康对照组肾小管间质中的表达。结果：1.D组及T组大鼠24小时尿蛋白总量、血肌酐、血清白蛋白、肾间质纤维化面积等与同期C组相比,有显著差异(P<0.05)；T组(缬沙坦治疗组)上述病变相对D组有减轻。2.动物免疫组化结果：C组中AngⅡ、ET-1及HIF-1α在肾间质及肾小管上皮细胞内几乎无表达,D组及T组中三者的表达均有不同程度的增加,且随着时间及病程的进展,三者的表达逐渐增强,T组与D组相比较,上述因子表达相对减少。3.动物RT-PCR结果：RT-PCR结果显示,随时间的推移,D组及T组AGT、ET-1及HIF-1αmRNA的表达逐渐增高,同期的T组较D组AGT、ET-1及HIF-1αmRNA的表达均有减弱,且8周及12周组间比较,差异有显著统计学意义(均P<0.05)。4.DN患者临床指标与肾脏：(1)DN患者肾脏中存在RIF。(2)对照组肾脏中AngⅡ几乎无表达、ET-1和HIF-1α有少量表达,DN组中表达明显增强。(3) AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN患者肾小管间质中的表达与RIF程度呈正相关。(4) AngⅡ、ET-1及HIF-la的表达与DN患者血肌酐水平呈正相关,与24小时尿蛋白定量、血糖及血浆白蛋白无相关性。结论：1.在DN大鼠模型及DN患者中,均存在不同程度的RIF,且AngⅡ、ET-1及HIF-1α在肾小管上皮细胞及间质中有不同程度的表达；三者的表达与肾功能减退水平均呈正相关,提示AngⅡ、ET-1及HIF-1α表达升高可能参与DN肾间质纤维化的进展。2.缬沙坦可减少AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN肾组织中的表达,减轻肾小管间质损害,延缓RIF的进展,防治DN肾间质纤维化。

AngⅡ、ET-1及HIF-1α在糖尿病肾病肾间质纤维化中的作用及干预研究

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