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腺病毒介导的hHCN4表达载体的构建及其转染人胚肾细胞的研究

作　者: 曹程
导　师: 王高频
学　校: 辽宁医学院
专　业: 内科学
关键词: 超极化激活环核苷酸门控通道基因人胚肾细胞腺病毒载体腺病毒
分类号: R541.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 17次
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内容摘要

目的⑴构建由腺病毒介导的人超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）的表达载体，并在人胚肾细胞（HEK293A）中包装成重组腺病毒AV-hHCN4-IRES/eGFP。同时构建其阴性对照载体AV-IRES/eGFP。⑵将重组腺病毒表达载体及其阴性对照分别以最佳感染复数（MOI）转染人胚肾细胞（HEK293A），比较各组在人胚肾细胞中的表达量，为生物起搏技术的应用奠定了分子实验基础。方法由于难以扩增全长hHCN4，采用分段连接的方式构建入门载体pDown-hHCN4-IRES/eGFP。利用Gateway Technology克隆技术将pDown-hHCN4-IRES/eGFP与腺病毒质粒pAV.Des1d进行LR反应，构建腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP。通过酶切分析，PCR和测序进行鉴定。提纯后利用脂质体Lipofectamine2000介导转染HEK293A细胞，通过eGFP基因绿色荧光表达检测转染情况，完成病毒包装，成功构建重组腺病毒AV-hHCN4-IRES/eGFP及阴性对照腺病毒AV-IRES/eGFP。采用终点稀释法进行腺病毒滴度测定。以最佳感染复数MOI值将以上两种重组腺病毒分别转染人胚肾细胞（HEK293A），Western blot方法检测转染细胞中hHCN4基因蛋白表达情况。结果⑴鉴定腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP：酶切鉴定，载体被PacI酶切出2082bp和37334bp的条带；重组腺病毒载体中的hHCN4序列与Genebank中的hHCN4（NM₀05477.2）CDS区完全吻合，插入片段方向正确。同时构建了阴性对照组pAV-IRES/eGFP。⑵包装腺病毒：转染HEK293A细胞，荧光倒置显微镜下观察到实验组及其阴性对照的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达并有明显的细胞病变效应（CPE）。提示腺病毒包装成功，病毒滴度检测分别为1.26×108pfu/ml、1.15×10⁸pfu/ml。⑶Western blot检测结果：实验组蛋白表达量明显高于阴性对照组，有统计学意义（P＜0.01）。结论⑴成功构建了腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP，以及阴性对照组pAV-IRES/eGFP。⑵成功包装腺病毒AV-hHCN4-IRES/eGFP、AV-IRES/eGFP，并检测出病毒滴度。⑶hHCN4基因蛋白在人胚肾细胞中成功表达。

全文目录

中文论著摘要  4-6
英文论著摘要  6-8
英文缩略语表  8-9
前言  9-10
实验材料与方法  10-24
实验结果  24-37
讨论  37-41
结论  41-42
本研究创新性的自我评价  42-43
参考文献  43-46
附录  46-60
  综述  46-57
    参考文献  53-57
  在学期间科研成绩  57-58
  致谢  58-59
  个人简历  59-60

腺病毒介导的hHCN4表达载体的构建及其转染人胚肾细胞的研究

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