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AFP调控的携带Mn-SOD的溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究

作　者: 孔彦平
导　师: 刘新垣
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝癌 MnSOD AFP 溶瘤腺病毒
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

癌症由于具有死亡率高、生存率低及治疗效果差等特点被认为是当前医学和生物学研究的难题。世界范围内,癌症已经成为位于居民死因前列[1]的一种疾病。其中肝细胞癌是最常见恶性肿瘤之一,在我国的发病率也很高,某些地区甚至成为死亡率最高的恶性肿瘤。传统的治疗癌症的方法主要有手术,放疗和化疗。但由于存在易转移、扩散和肿瘤不能根治等缺点,目前人们正积极探索更加安全有效的能彻底杀伤肿瘤的治疗策略,肿瘤的基因治疗是其中一种有效的策略。肿瘤根本上是一种多基因病,是基因突变积累的结果。肿瘤基因治疗的出现有望成为一种能治愈肿瘤的新型治疗方法。锰超氧化物歧化酶基因(manganese superoxide dismutase, MnSOD)是一新型肿瘤抑制基因。实验证实,MnSOD具有防止正常细胞转化为肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的快速生长和促使肿瘤细胞凋亡的功能,因而具有很好的抗肿瘤效果。此外,对于基因治疗载体的选择非常重要。腺病毒载体由于具有包装容量大、安全稳定及插入外源基因后不影响病毒复制的同时能使外源基因良好表达等优点而得到广泛使用。将腺病毒E1B55Kd区域删除并用肝癌特异性甲胎蛋白启动子(alpha-fetoprotein, AFP)代替腺病毒E1A基因启动子,改造后的溶瘤腺病毒Ad.enAFP-E1A-△E1B55Kd能极大的提高病毒感染的靶向性,并使携带的MnSOD基因特异性的作用于肝癌细胞。本研究中,利用经过改造的溶瘤腺病毒Ad.enAFP-E1A-△E1B55Kd作为载体携带治疗基因MnSOD,得到目的病毒Ad.enAFP-E1A-△E1B55Kd-MnSOD。PCR方法鉴定病毒构建正确;显微镜观察病毒感染细胞后的细胞形态变化和细胞的凋亡情况;MTT法检测病毒对肝癌细胞的特异杀伤能力;结晶紫染色实验观察病毒对肝正常细胞的安全性以及Western blot实验检测细胞凋亡的机制等。结果显示经目的病毒感染后肝癌细胞出现明显的病变现象和生长抑制,而对肝正常细胞影响较小具有较高的安全性。此外目的病毒处理后能明显引起特异性的肝癌细胞凋亡,表明构建的目的病毒具有很好的靶向性,并且所携带治疗基因MnSOD能通过促进肿瘤细胞的凋亡达到抑制肿瘤细胞生长的效果。总之,本文构建了肝癌特异性启动子AFP调控的携带MnSOD的溶瘤腺病毒Ad.enAFP-E1A-△E 1B55Kd-MnSOD,研究发现该病毒具有特异性地杀伤肝癌细胞并抑制其生长的效果,同时能诱导肝癌细胞的凋亡,且对肝正常细胞的影响较小,为其进一步的体内抗癌实验及临床肝癌治疗研究打下了初步的基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
第一章肝癌的现状和靶向基因--病毒治疗的概述  12-23
  1.1 肝癌的现状  12-13
  1.2 肿瘤的生物治疗  13-23
    1.2.1 肿瘤的基因治疗  14-17
    1.2.2 肿瘤的病毒治疗  17-21
      1.2.2.1 病毒载体的构建  19
      1.2.2.2 病毒靶向性的改造策略  19-21
    1.2.3 靶向基因-病毒治疗  21-22
    1.2.4 本课题的研究目的和意义  22-23
缩略词  23-24
第二章 AFP 调控的携带 Mn-SOD 的腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用的研究  24-62
  2.1 实验材料  24-29
    2.1.1 菌株与质粒  24
    2.1.2 腺病毒  24
    2.1.3 工具酶及生化试剂  24-25
    2.1.4 主要溶液的配制  25-26
    2.1.5 细胞株  26-27
    2.1.6 抗体  27
    2.1.7 实验主要仪器  27-28
    2.1.8 合成引物序列  28-29
  2.2 实验方法  29-50
    2.2.1 重组质粒 pAd.enAFP-E1A-△E1B55Kd-MnSOD 的构建  29-36
      2.2.1.1 基因MnSOD 表达框的获取和鉴定  32-34
      2.2.1.2 质粒 pAd.enAFP--E1A-△E1B55Kd-MnSOD 的获取  34-36
    2.2.2 重组腺病毒的包装、鉴定、扩增、纯化和滴度的测定  36-43
      2.2.2.1 重组腺病毒的包装  36-38
      2.2.2.2 病毒的鉴定  38-40
      2.2.2.3 病毒的扩增  40-41
      2.2.2.4 CsCl 梯度离心纯化病毒  41
      2.2.2.5 重组病毒的滴度测定  41-43
    2.2.3.病毒的体外杀伤效果的检测  43-45
      2.2.3.1 MTT 检测细胞存活率  43
      2.2.3.2 Hoechst33342 染色观察细胞凋亡  43-44
      2.2.3.3 结晶紫实验观察细胞毒性  44-45
    2.2.4 Western blot 检测蛋白表达  45-50
  2.3 结果和分析  50-60
    2.3.1 病毒的鉴定  50-53
    2.3.2 MTT 法证明病毒对肝癌细胞有杀伤作用  53-55
    2.3.3 光学显微镜下观察到细胞形态的改变  55
    2.3.4 Hoechst33342 染色检测到细胞发生凋亡  55-57
    2.3.5 结晶紫染色定性检测到病毒对肝癌细胞有杀伤作用  57-58
    2.3.6 Western blot 证实病毒通过线粒体途径诱导细胞凋亡  58-60
  2.4 实验结论  60
  2.5 讨论和展望  60-62
参考文献  62-67

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