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马主要过敏原Equ c1的重组表达及其低过敏原性的改造

作　者: 彭俊玲
导　师: 马三梅; 陶爱林
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Equ c1 重组表达 亲和纯化 免疫印迹 定点突变
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 38次
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内容摘要


目的：分泌蛋白Equ c1是一种主要过敏原，能够在大多数对马过敏的病人体内诱发IgE调节的I型过敏反应，本文旨在探索重组低变应原性过敏原Equ c1的研究，为其在特异性免疫治疗方面的应用打下基础。方法：本研究在大肠杆菌中重组表达了经密码子优化之后的成熟肽区段的Equ c1，并对其进行表达条件的优化，亲和纯化和Western-Blot鉴定。利用MHCⅡ Service2.0软件对Equ c1的T细胞主要过敏原表位进行预测，用定点突变技术改变Equ c1编码特定氨基酸的密码子，并在大肠杆菌中表达具有低抗原表位的重组蛋白，对其进行了三级结构的模拟和分析以及Western-Blot鉴定。结果：重组Equ c1-Rosetta菌株在加入浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂0.5μL，37℃诱导表达6h条件下，能取得最优的蛋白表达效果；重组Equ c1蛋白的SDS-PAGE鉴定结果显示，目的条带在22KDa的位置，纯化洗脱中峰和洗脱后峰得到了比较纯的目的蛋白。通过对三个高抗原表位进行单位点突变和组合突变，共表达一种重组Equ c1蛋白和7种突变的Equ c1蛋白。结论：改造之后，第50、120、153三个抗原性最高的九肽与MHCⅡ类分子结合力都降低到了0.42以下，达到了我们预期的效果。三级结构模拟结果显示，位点突变前后，蛋白的三级结构均没有发生明显变化。利用StrepII tag的Western-Blot结果表明纯化后的重组蛋白与突变蛋白均为目的蛋白。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
缩略词表及中英文对照  5-8
1 前言  8-14
  1.1 Equ c1 研究进展  8-10
  1.2 重组低变应原性过敏原与特异性免疫治疗  10-12
  1.3 密码子优化  12-13
  1.4 抗原表位预测  13-14
2 材料与试剂  14-18
  2.1 材料  14
  2.2 主要试剂  14-15
  2.3 主要仪器  15-16
  2.4 培养基及常用试剂配方  16-18
3 实验方法  18-26
  3.1 Equ c1 蛋白的密码子优化  18
  3.2 引物设计  18-19
  3.3 Equ c1 基因克隆载体构建  19-21
  3.4 表达载体的构建  21
  3.5 表达载体转化 Rosetta  21-22
  3.6 重组载体转化步骤  22
  3.7 Equ c1 突变位点预测及载体构建  22-24
  3.8 蛋白诱导表达及表达条件的优化  24-25
  3.9 Equ c1 蛋白亲和纯化及冻干  25-26
  3.10 Western blot 鉴定目的蛋白  26
4 实验结果  26-53
  4.1 Equ c1 密码子优化结果  26-27
  4.2 Equ c1 基因的克隆  27-29
  4.3 重组 Equ c1-pET-44a 克隆载体的构建  29-30
  4.4 重组 Equ c1-pET-44a 表达菌株的构建  30
  4.5 重组 Equ c1 蛋白诱导表达 SDS-PAGE 鉴定结果  30-31
  4.6 重组 Equ c1 蛋白表达条件的优化  31-33
  4.7 重组 Equ c1 蛋白纯化结果  33-34
  4.8 Western-Blot 鉴定纯化后的蛋白  34
  4.9 Equ c1 突变蛋白表位预测和突变基因的获取  34-37
  4.10 重组 Equ c1 蛋白 153 突变菌株的构建及表达结果  37-39
  4.11 重组 Equ c1 蛋白 120 突变菌株的构建及表达结果  39-41
  4.12 重组 Equ c1 蛋白突变 50 菌株的构建及表达结果  41-43
  4.13 重组 Equ c1 蛋白 50-120 突变菌株的构建及表达结果  43-45
  4.14 重组 Equ c1 蛋白 50-153 突变菌株的构建及表达结果  45-47
  4.15 重组 Equ c1 蛋白 153-120 突变菌株的构建及表达结果  47-49
  4.16 重组 Equ c1 蛋白 153-120-50 突变菌株的构建及表达结果  49-51
  4.17 重组突变蛋白的 Western-Blot 鉴定  51-52
  4.18 蛋白三级结构模拟  52-53
5 讨论  53-55
6 结论  55-57
参考文献  57-62
附录  62-70
在学期间发表论文清单  70-71
致谢  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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