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FATS表达调控及其抑制p21蛋白降解的机制研究

作　者: 张喜凤
导　师: 李政
学　校: 天津医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: p53应答元件 p21 FATS 定点突变 DNA损伤 乙酰化
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的通过在全基因组规模上采用微阵列-比较基因组杂交(array-CGH)技术分析小鼠肿瘤细胞染色体基因的拷贝数变化,本课题组在国际上首次发现一个新的并且进化上保守的抑癌基因,并命名为FATS (fragile-site associated tumor suppressor)。进一步通过筛选小鼠睾丸cDNA表达文库,本课题组在国际上首次发现一个新的FATS mRNA表达转录变异体(Genbank收录号：GQ499374)。初步研究证实FATS抑制去乙酰化酶1(HDAC1)结合细胞周期抑制性因子p21蛋白,并增强p21蛋白的乙酰化修饰和稳定性。本研究的目的是要进一步阐明FATS基因表达的调控规律,并研究p21蛋白乙酰化修饰和其蛋白稳定性的有机联系。方法1.生物信息学分析表明FATS基因启动子区域存在p53抑癌转录因子的结合基序。用PCR技术扩增FATS基因启动子区域中含潜在p53结合位点的目的片段(约746kb),并构建受FATS基因启动子调控的荧光素酶报告基因载体(746-Luc),将746-Luc单独转染或与p53共转染U87细胞(p53野生型),接着用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)检测转染细胞中的荧光素酶活性,确定p53对FATS基因启动子的调控作用。2.用染色质免疫沉淀方法检测U87细胞中FATS基因启动子DNA特异性结合p53转录因子的情况,验证FATS基因表达受p53调控。3.对FATS基因启动子中p53结合基序的关键碱基实施定点突变,构建突变位点报告基因载体M-746-Luc,将746-Luc和M-746-Luc分别单独转染或与p53共转染细胞,用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)检测转染细胞中的荧光素酶活性,进一步分析p53结合顺式元件的特异性突变对FATS启动子转录活性的影响。4.利用p53应答DNA损伤反应的特性,用Etoposide处理U87细胞诱导DNA损伤,接着用Western blot方法检测细胞中FATS基因表达水平,以未被药物处理的细胞为对照,分析DNA损伤状态下细胞中FATS基因的转录水平。5.将GST-C8融合表达载体转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,纯化GST-C8蛋白,用于蛋白质相互作用研究。6.用化学合成法合成乙酰化和未乙酰化的p21C-端蛋白多肽,进行GSTpull-down实验,确定p21乙酰化对其蛋白质稳定性的影响。7.分析去乙酰化酶抑制剂TSA对细胞中p21蛋白表达水平的影响。结果1.与单独转染746-Luc的细胞相比,共转染746-Luc和p53的U87细胞(p53野生型)中荧光素酶活性显著增强。2.FATS基因启动子DNA能与p53转录因子发生特异性结合。3.对FATS基因启动子中p53结合基序的关键碱基实施定点突变,其调控荧光素酶报告基因的活性显著下降。4.与未被药物处理的对照细胞相比,用Etoposide处理U87细胞诱导DNA损伤后,细胞中FATS基因表达水平明显升高。5. GST pull-down实验结果显示：纯化的GST-C8蛋白能结合未被乙酰化修饰的p21蛋白C-端结构域,而p21蛋白的乙酰化修饰能显著抑制C8-p21蛋白质相互作用。6.用去乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞后,细胞中p21蛋白的表达水平明显增高。结论1. FATS是一个新的p53转录调控靶基因。2. FATS基因启动子中p53结合基序发生位点特异性突变后,p53对FATS启动子的转录活性大大减弱。3.DNA损伤后细胞中FATS基因的转录水平升高,进一步证实p53对FATS基因的表达调控作用。4.p21蛋白的乙酰化修饰对其蛋白的稳定性具有重要作用。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语  11-12
前言  12-14
  研究现状、成果  12-13
  研究目的、方法  13-14
一、材料和方法  14-28
  1.1 实验材料  14-18
    1.1.1 菌株、质粒和细胞系  14
    1.1.2 主要试剂及配制  14-18
    1.1.3 主要仪器设备  18
  1.2 实验方法  18-28
    1.2.1 质粒的构建  18-20
    1.2.2 细胞培养和转染  20-21
    1.2.3 荧光素酶活性检测  21
    1.2.4 Western Blot实验  21-23
    1.2.5 RT-PCR  23-24
    1.2.6 GST pull-down assay  24-25
    1.2.7 染色质免疫沉淀  25-28
二、结果  28-36
  2.1 FATS基因是p53的一个转录靶点  28-30
  2.2 定点突变和DNA损伤影响FATS基因转录  30-33
  2.3 乙酰化修饰增强p21蛋白的稳定性  33-36
讨论  36-42
结论  42-43
参考文献  43-49
发表论文和参加科研情况说明  49-50
综述  50-63
  综述参考文献  59-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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