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细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达、纯化和酶活性的检测

作　者: 王绚
导　师: 景涛
学　校: 兰州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶(FBPA) 分子克隆蛋白纯化生物信息学预测
分类号: R383.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：利用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶(FBPA)的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆、表达、纯化,获得活性蛋白。方法：利用多种生物信息学软件分析细粒棘球绦虫的FBPA的拓扑结构、生物学以及免疫功能特征等。限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ对重组质粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的片段,亚克隆入表达载体pET30a,筛选重组克隆并测序,将正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并建立酶反应体系,通过NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的变化来测定重组蛋白EgFBPA的酶催化活性。结果：EgFBPA是一个全长的1092bp的基因,编码363个氨基酸,软件分析表明其等电点(PI)为8.34,分子量为39803.5Da。亚细胞定位分析显示该蛋白是无信号肽的细胞质蛋白,属于稳定蛋白。结构域和保守功能域的预测结果发现FBPAI的激活位点VYLEGTLLKPN (222aa-232aa)和TIMβ/α筒状结构(6aa-346aa)。二级结构以α-螺旋和环状结构居多,无跨膜区,有10种类型的活性位点。以1ADO A为模板,构建出了FBPA的三级结构。经PCR (聚合酶链反应)、双酶切和测序证实pET30a (+)-EgFBPA成功构建。SDS-PAGE (十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电)证实成功表达重组蛋白,且该蛋白是具有高效表达的可溶性蛋白。Ni-NTA柱子纯化后得到纯度较高的FBPA, Bradford法测定蛋白浓度为0.50±0.02mg/ml。结论：经生物信息学预测细粒棘球绦虫FBPA与人的FBPA的同源性是69%。EgFBPA可能是潜在的药物靶点。重组质粒Pet30a (+)-FBPA在大肠杆菌BL21中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度的有活性的蛋白,为进一步研究其生物学功能及其抗体、药物靶点的研制奠定了基础。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-9
前言  9-12
第一章利用EST序列进行生物信息学预测  12-27
  1.1 材料  12
  1.2 方法  12-13
  1.3 结果  13-25
  1.4 讨论  25-26
  1.5 小结  26-27
第二章细粒棘球绦虫成虫EgFBPA重组蛋白的诱导表达、纯化  27-41
  2.1 材料  27-28
  2.2 方法  28-35
  2.3 结果  35-39
  2.4 讨论  39-40
  2.5 小结  40-41
第三章细粒棘球绦虫成虫EgFBPA重组蛋白的酶活性的检测  41-46
  3.1 材料  41
  3.2 方法  41-43
  3.3 结果  43-44
  3.4 讨论  44-45
  3.5 小结  45-46
第四章结论  46-47
  4.1 主要结论  46
  4.2 研究的局限性及展望  46-47
参考文献  47-52
综述  52-55
  参考文献  54-55
在读期间研究成果  55-56
致谢  56-57
英文缩略语表  57

细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达、纯化和酶活性的检测

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