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接枝密度梯度表面的构建及其对细胞迁移行为的调控

作　者: 吴金丹
导　师: 高长有
学　校: 浙江大学
专　业: 高分子材料
关键词: 聚乙二醇碱性成纤维细胞生长因子细胞迁移梯度表面图案细胞黏附
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

细胞迁移是细胞的一个重要功能,在组织再生如血管生成、伤口愈合和骨形成过程中起关键作用。其中,血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移是治疗心血管疾病的重要问题。本论文制备了不同分子量(MW2kDa、5kDa和10kDa)和接枝质量(0-859ng/cm2)的聚乙二醇(PEG)表面,并采用X射线光电子能谱仪(XPS)和石英晶体微天平(QCM-D)等技术进行了表征。VSMCs黏附和迁移主要是由PEG的接枝质量而非分子量调控。VSMCs在均匀的PEG表面无规迁移。它们的迁移速率随着PEG接枝质量的增加而先增大后减少；当接枝质量为300-500ng/cm2时,细胞迁移速率最快(～24μm/h)。对细胞的黏附强度、细胞骨架排列以及黏附相关基因和蛋白表达水平进行了研究,发现在PEG接枝密度适中的表面,细胞粘附力适当,表现出最高的迁移速率。基于均匀PEG表面密度对细胞迁移的影响规律,采用注射法制备了PEG接枝密度梯度表面。由于PEG的阻粘作用,随着其密度的增加,VSMCs黏附的数量减少,细胞铺展面积变小。梯度表面在一定程度上可以诱导VSMCs沿梯度方向取向和定向移动。在PEG梯度表面构建20μm条带图案,细胞趋化迁移和迁移的方向性得到进一步提高。细胞迁移的方向性和趋化指数分别高达0.7和0.53,有69%的细胞定向迁移至PEG密度低的区域。为了更好地诱导细胞定向迁移,选用了生物活性更强的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行研究。通过肝素与bFGF之间特异性的相互作用在表面上固定bFGF分子。制备了一系列均匀的bFGF表面,密度的变化范围为0-295ng/cm2,免疫荧光染色技术证实了bFGF仍保留有生物活性。bFGF的密度对VSMCs的运动性影响显著,却对骨髓间质干细胞(MSCs)和内皮细胞(ECs)的迁移无明显影响。随着bFGF密度的增加,VSMCs的迁移速率先增加随后减小,在83ng/cm2达到最大(-22μm/h)。对细胞黏附、铺展面积、细胞粘附力、细胞骨架排列和迁移相关蛋白的表达水平进行了研究,揭示在不同密度的bFGF表面,细胞的迁移是通过调节细胞内的信号,特别是myosin IIA的表达来调控的。基于上述研究,利用注射法制备了bFGF梯度。在梯度表面,bFGF的密度逐渐增加,从约130ng/cm2增加至300ng/cm2,斜率为17ng/cm2/mm。由于bFGF强的化学诱导性,细胞沿着bFGF梯度定向排列,约有60%的细胞与梯度方向夹角小于30°,约有25%细胞取向角小于10°。此外,bFGF梯度能有效诱导VSMCs的定向迁移,高达60%的细胞倾向于迁移至高密度bFGF的区域,细胞迁移的方向性和趋化性显著提高。仅仅依靠化学梯度的作用,趋化指数和方向性指数分别高达0.4和0.5。本论文成功地制备了有效诱导细胞定向迁移的梯度材料,阐明了材料诱导细胞迁移的规律和机理,为设计性能更好的生物材料提供新的思路。

全文目录

致谢  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-16
1 文献综述  16-44
  1.1 再生医学  16-17
  1.2 体内梯度和细胞迁移  17-22
    1.2.1 细胞迁移的过程  17-19
    1.2.2 体内的梯度  19-21
    1.2.3 梯度诱导细胞迁移的机理  21-22
  1.3 制备梯度的方法  22-30
    1.3.1 Top down技术  22-25
      1.3.1.1 等离子体处理  23-24
      1.3.1.2 电晕处理法  24
      1.3.1.3 紫外线辐照法  24
      1.3.1.4 化学刻蚀技术  24-25
    1.3.2 “Bottom up”技术  25-28
    1.3.3 三维梯度材料的制备技术  28-30
  1.4 梯度表面表征技术  30-36
    1.4.1 接触角分析(Water contact angle analysis)  31
    1.4.2 红外衰减全反射(Fourier transform infrared-attenuated total reflection)  31
    1.4.3 X-射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy)  31-32
    1.4.4 椭圆偏光法(Ellipsometry)  32-33
    1.4.5 原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)  33
    1.4.6 二次离子质谱(Secondary ion mass spectrometry,SIMS)  33-35
    1.4.7 表面等离子体共振分析(Surface plasma resonance,SPR)  35
    1.4.8 荧光探针法(Fluorescence)  35-36
  1.5 梯度材料对细胞迁移和组织再生的影响  36-43
    1.5.1 物理梯度  36-38
    1.5.2 化学梯度  38-40
    1.5.3 混合梯度  40-41
    1.5.4 细胞在三维梯度材料的迁移  41-43
  1.6 课题提出  43-44
2 聚乙二醇均匀表面的制备及对细胞迁移的影响  44-65
  2.1 实验部分  44-50
    2.1.1 原料和试剂  44-45
    2.1.2 细胞培养  45
    2.1.3 硅烷接枝  45
    2.1.4 PEG接枝  45-46
    2.1.5 测试与表征  46-47
    2.1.6 细胞黏附  47
    2.1.7 细胞迁移  47
    2.1.8 细胞粘附力的测定  47-48
    2.1.9 细胞黏着斑和肌动蛋白纤维分析  48
    2.1.10 纤维连接蛋白分析  48-49
    2.1.11 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)  49-50
    2.1.12 统计分析  50
  2.2 结果与讨论  50-64
    2.2.1 硅烷接枝反应  50-51
    2.2.2 PEG表面的制备和表征  51-55
    2.2.3 细胞粘附  55-56
    2.2.4 细胞迁移  56-64
  2.3 本章小结  64-65
3 图案化PEG梯度表面诱导细胞定向迁移  65-81
  3.1 实验部分  65-68
    3.1.1 实验原料与细胞来源  65
    3.1.2 硅烷梯度制备  65-66
    3.1.3 PDMS印章的制备  66-67
    3.1.4 复合条形微图案的梯度表面的制备  67
    3.1.5 接枝PEG  67
    3.1.6 表面性质的表征  67
    3.1.7 细胞黏附实验  67-68
    3.1.8 细胞黏着斑和肌动蛋白纤维分析  68
    3.1.9 细胞纤维连接蛋白分析  68
    3.1.10 细胞迁移  68
    3.1.11 统计分析  68
  3.2 结果与讨论  68-80
    3.2.1 PEG梯度的制备和表征  68-72
    3.2.2 VSMCs的黏附  72-73
    3.2.3 细胞的排列  73-75
    3.2.4 细胞黏着斑和肌动蛋白纤维分析  75-78
    3.2.5 细胞定向迁移  78-80
  3.3 本章小结  80-81
4 碱性成纤维细胞生长因子的接枝密度对细胞迁移的影响  81-100
  4.1 实验部分  81-85
    4.1.1 实验原料和试剂  81-82
    4.1.2 bFGF样品制备  82-83
    4.1.3 表面性质表征  83-84
    4.1.4 细胞迁移  84
    4.1.5 细胞黏附试验  84
    4.1.6 划痕修复实验  84
    4.1.7 细胞黏着斑和肌动蛋白分析  84
    4.1.8 细胞迁移相关蛋白的表达  84-85
    4.1.9 统计分析  85
  4.2 结果与讨论  85-98
    4.2.1 肝素和bFGF表面的制备和表征  85-89
    4.2.2 细胞迁移  89-93
    4.2.3 bFGF调控细胞迁移的机制  93-98
  4.3 本章小结  98-100
5 碱性成纤维细胞生长因子梯度诱导细胞的定向迁移  100-112
  5.1 实验部分  100-102
    5.1.1 实验原料与试剂  100
    5.1.2 硅烷梯度的制备  100
    5.1.3 bFGF梯度的制备  100-101
    5.1.4 测试与表征  101
    5.1.5 细胞黏附  101
    5.1.6 细胞黏着斑和肌动蛋白纤维分析  101
    5.1.7 细胞迁移相关蛋白的表达  101-102
    5.1.8 细胞迁移  102
    5.1.9 统计分析  102
  5.2 结果与讨论  102-111
    5.2.1 bFGF梯度的制备和表征  102-104
    5.2.2 VSMCs的黏附  104-105
    5.2.3 细胞的排列  105-106
    5.2.4 细胞黏着斑和肌动蛋白纤维分析  106-107
    5.2.5 Myosin ⅡA表达  107-108
    3.2.6 细胞定向迁移  108-111
  5.3 本章小结  111-112
全文总结  112-114
建议与展望  114-115
参考文献  115-132
作者简介  132-133

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