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小鼠脂肪干细胞分离培养及生物特性研究

作　者: 常卓
导　师: 侯玲玲
学　校: 北京交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脂肪干细胞 分离培养 成脂诱导 成骨诱导 精子诱导
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)是脂肪组织中存在的一种成体干细胞,具有便于取材,可向三个胚层方向分化等优点。本实验主要研究ASCs的体外分离培养条件优化；ASCs向脂肪细胞、成骨细胞、精子细胞的诱导分化；Reversine对ASCs生物学特性的影响。通过MTT、免疫组化及RT-PCR证明,分离培养的ASCs在35代内保持良好的生物学特性,P5、P15、P25细胞倍增时间分别为34.6h、37.8h、38.3h；持续表达细胞表面抗原CD29、CD44,不表达造血干细胞特异表面抗原CD45；表达特异性基因CD29、CD34、CD90、Sca-1、c-Myc,不表达Sox-2和Oct-4。说明本实验采用的ASCs的分离培养方法能够保持ASCs的未分化状态。ASCs在成脂诱导剂诱导下分化为脂肪细胞,诱导第六天油红O染色计算P5ASCs诱导率为78.3%±9.2%,P15ASCs诱导率为73.9%±8.7%,P25ASCs诱导率为67.0%±1.52%,不同代数间诱导率无显著性差异；在成骨诱导剂诱导下分化为成骨细胞,第11天进行茜素红染色,钙结节被染成深红色,放大100倍视野下计数被染色的钙结节数量,P5ASCs为15±2.4个,P15ASCs为13±3.6个,不同代数之间无显著性差异；P5ASCs与睾丸组织共培养,10天后RT-PCR结果显示表达精子细胞特异基因Prml、Acr。Reversine终浓度大于5μmol/L时对ASCs有明显的细胞毒性,浓度为1μmol/L时,对ASCs的增殖率无明显影响,但可以显著增加ASCs向脂肪细胞,成骨细胞诱导分化的效率。本实验建立了ASCs分离培养体系,ASCs可以在此体系内长期培养并保持良好的生物学特性：证明了ASCs具有在适当诱导条件下向脂肪细胞、成骨细胞以及精子细胞分化的潜能；同时证明了reversine可以提高ASCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的转分化率,是一种有效的提高ASCs分化潜能的小分子。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
1 引言  11-17
  1.1 脂肪干细胞  11-12
  1.2 ASCs的分离培养与鉴定  12-14
    1.2.1 ASCs的分离培养  12-13
    1.2.2 ASCs的鉴定  13-14
  1.3 ASCs的生物学特性  14-17
    1.3.1 ASCs的自我更新能力  14
    1.3.2 ASCs的分化能力  14-15
    1.3.3 一种具有生物活性的小分子reversine  15-17
2 实验材料  17-21
  2.1 细胞供体  17
  2.2 细胞培养所用主要培养基  17
  2.3 主要试剂和试剂盒  17-18
  2.4 主要实验仪器及耗材  18-19
  2.5 主要溶液的配制  19-21
    2.5.1 细胞培养所用培养基及主要溶液配制  19-20
    2.5.2 核酸电泳缓冲液的配制  20-21
3 实验方法  21-31
  3.1 ASC的原代分离  21
  3.2 ASC的传代  21-22
  3.3 ASC的冻存  22
  3.4 ASC的复苏  22
  3.5 RT-PCR检测特定基因的表达  22-25
    3.5.1 从细胞中提取总RNA  22-23
    3.5.2 RNA的反转录  23
    3.5.3 PCR反应  23-25
    3.5.4 PCR产物的鉴定(1%琼脂糖凝胶电泳)  25
  3.6 免疫组化  25-26
  3.7 MTT法测定ASCs生长曲线  26
  3.8 ASCs的多向分化潜能  26-31
    3.8.1 诱导ASCs向脂肪细胞分化及鉴定  26-27
    3.8.2 诱导ASCs向成骨细胞分化及鉴定  27-28
    3.8.3 诱导ASCs向精子细胞分化及鉴定  28-30
      3.8.3.1 睾丸组织的分离培养  28-29
      3.8.3.2 ASCs与睾丸组织共培养  29
      3.8.3.3 睾丸组织条件培养液及RA共同作用诱导ASCs向精子细胞分化  29-30
    3.8.4 Reversine对ASCs生物学特性的影响  30-31
      3.8.4.1 MTT法测定reversine对ASCs细胞活性的影响  30
      3.8.4.2 RT-PCR检测不同浓度reversine对ASCs干性基因的影响.  30
      3.8.4.3 Reversine作用对ASCs分化潜能的影响  30-31
4 结果  31-51
  4.1 ASC的分离、培养及鉴定  31-41
    4.1.1 ASC的形态  31-33
    4.1.2 ASCs的免疫组化鉴定  33-40
    4.1.3 RT-PCR检测ASCs特异基因的表达  40
    4.1.4 ASCs的生长曲线和倍增时间  40-41
  4.2 ASCs的多向分化潜能  41-46
    4.2.1 将ASCs诱导为脂肪细胞  41-43
    4.2.2 将ASCs诱导为成骨细胞  43-45
    4.2.3 诱导ASCs向精子细胞分化  45-46
  4.3 Reversine对ASCs生物学特性的影响  46-51
    4.3.1 reversine对ASCs活性的影响  46-48
    4.3.2 RT-PCR检测不同浓度reversine对ASCs干性基因的影响  48-49
    4.3.3 Reversine对ASCs分化潜能的影响  49-51
5 讨论  51-54
6 结论  54-55
参考文献  55-59
作者简历  59-61
学位论文数据集  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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