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斑马鱼肝脏再生正向遗传学ENU突变筛选模型的建立

作　者: 鹿薇
导　师: 罗凌飞
学　校: 西南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝脏再生 斑马鱼 Mtz/NTR系统 正向突变筛选
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


肝脏是人体内重要的消化器官,调控着各种代谢平衡。由于其显著的医学价值,肝脏的再生过程受到了广泛的关注和研究。但迄今为止,人们对于调控肝脏再生的分子机理研究的并不是十分透彻,虽然发现了一些调控再生过程的信号途径和转录因子,但是许多调控肝脏再生过程的重要基因尚未发现,这就使得人们对于肝脏的再生过程缺乏完整性认识,而这些问题的解决将更有效地指导重大肝脏疾病的治疗。对于肝脏再生的研究比较普遍的是以小鼠作为模式生物,但由于此类动物不适用于大规模正向遗传突变的筛选工作,导致对于影响肝脏再生的重要分子的筛选工作并不全面,限制了研究的范围,而斑马鱼肝脏再生正向突变筛选模型的建立恰好解决了这一问题。本实验中,首先构建了转基因质粒Bluescript II-KS-I-lfabp-Dendra2-NTR将斑马鱼肝脏特异性启动子lfabp连接到Dendra2-NTR的上游,使肝脏细胞特异性表达细菌的硝基还原酶(NTR)和显示绿色荧光。在斑马鱼胚胎发育的单细胞时期注射0.15ng转基因质粒到动物极细胞中,经过几代繁殖后筛选稳定遗传的lfabp:Dendra NTR转基因斑马鱼系,用于肝脏再生正向突变筛选实验以及肝脏再生细胞来源的研究。Mtz/NTR系统特异性介导斑马鱼胚胎肝脏损伤以及恢复的主要理论依据为当肝脏细胞特异性表达NTR的斑马鱼胚胎培养在含有甲硝哒唑(Mtz)的溶液中时,NTR被NADH或NADPH还原后与Mtz结合,将无毒性的Mtz转化为有细胞毒性的代谢物,特异性致使表达NTR的肝脏细胞死亡。撤去药物后,经过一段时间的恢复肝脏细胞可以再生。通过实验证明,用10mM Mtz处理lfabp:Dendra2 NTR转基因系斑马鱼胚胎26小时后的处理组与对照组相比,处理组的胚胎肝脏明显变小,当继续用10mM Mtz处理达48小时后,通过共聚焦显微镜的仔细观察没有发现任何残存的肝脏细胞,并且经过24小时的恢复可看到明显的肝脏再生现象。证明所建立的lfabp:Dendra2 NTR转基因斑马鱼系能够特异性损伤肝脏,撤除药物后肝脏可以再生,能够满足肝脏再生正向突变筛选的要求。通过对于斑马鱼肝脏再生细胞来源的研究,发现在肝脏完全损伤的情况下,再生的肝细胞来源为非肝细胞的转化并且最早出现在靠近心脏附近的原肝脏位置,细胞数目也随着恢复时间的延长逐渐增多。已经有研究报道心脏中胚层的Fgf信号对于起始肝脏的发育至关重要。在肝脏完全损伤的情况下,很可能一定程度上重复了肝脏的发育的起始过程,心脏附近某些特殊的非肝脏细胞在接收了心脏的诱导条件后,转化形成正常的肝细胞参与肝脏的再生。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第一部分 文献综述  9-15
  1.1 肝脏的发育过程  10
  1.2 多种信号途径共同调控肝脏的发育  10-11
  1.3 肝脏发育过程中的一些关键基因  11-12
  1.4 肝脏再生的细胞来源  12
  1.5 本实验背景介绍及创新性  12-15
第二部分 引言  15-17
  2.1 研究的选题依据  15
  2.2 研究的思路和主要内容  15-17
第三部分 材料和方法  17-31
  3.1 实验动物  17
  3.2 试剂、耗材和仪器  17
  3.3 培养基和有关主要试剂的配置  17-19
  3.4 质粒和菌株  19
  3.5 实验方法  19-31
第四部分 实验结果  31-47
  4.1 PBLUESCRIPT Ⅱ-KS-Ⅰ-LFABP-DENDRA2-NTR的构建  31-37
  4.2 斑马鱼胚胎注射转基因质粒的结果  37-38
  4.3 UV处理LFABP:DENDRA2 NTR转基因斑马鱼胚胎变色结果  38-39
  4.4 MTZ/NTR系统介导斑马鱼肝脏缺失的条件优化  39-41
  4.5 MTZ/NTR系统特异性介导斑马鱼肝脏的损伤  41-43
  4.6 MTZ/NTR系统特异性介导斑马鱼肝脏损伤后可以再生  43-44
  4.7 肝脏完全损伤后,再生的肝细胞来源为非肝细胞的转化  44-47
第五部分 讨论分析和展望  47-51
  5.1 斑马鱼肝脏再生正向突变筛选模型的建立  47
  5.2 斑马鱼肝脏再生细胞的来源分析  47-48
  5.3 意义与展望  48-51
参考文献  51-55
致谢  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 医学研究方法 > 实验医学、医学实验 > 医用实验动物学
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