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小鼠NAFLD模型建立及Nrf2缺失对肝脏中CYP2A5表达的影响

作　者: 李晓冲
导　师: 张秀英
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 非酒精性脂肪肝 Nrf2 CYP2A5 基因敲除
分类号: R575.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着人们生活方式和饮食结构的改变，脂肪和糖类的过多摄入，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率呈逐年增高趋势。NAFLD主要包括，单纯脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎和肝硬化。某些病例还与肝脏肿瘤有关。“二次打击”学说被认为是其主要发病机制，但仍不十分清楚，目前有效的治疗药物也较少。核因子相关因子-2(NF-E2-related Factor2,Nrf2)，几乎存在各种细胞中，其作用引起了国内外广泛的研究。许多文献表明其在肝脏的相关疾病中，起着重要的作用。Nrf2可以通过调控细胞内抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶来抵抗氧化应激、减轻肝脏炎症、对抗肝细胞凋亡等。作为生物体主要的Ⅰ相代谢酶，CYP2A5是肝微粒体混合功能氧化酶系中最重要的一种，不仅与药物的生物转化等代谢环节密切相关，也和某些疾病的发生发展有关。研究表明，直接或间接由各种毒性化学物质或疾病引起的肝损伤，在炎症或肝硬化区域相邻的肝细胞CYP2A5是呈现增量表达。镉诱导氧化应激中，野生型小鼠肝细胞CYP2A5表达升高，而Nrf2敲除小鼠肝细胞CYP2A5表达没有变化。本实验前期研究结果已经证明，非酒精性脂肪肝模型鼠肝脏CYP2A5的表达量显著升高。但研究其两者在非酒精性脂肪肝发病过程中的变化及其相互影响，鲜有报道。为了探索非酒精性脂肪肝诱导的CYP2A5增量表达与Nrf2的相关性，本试验以野生型和敲除Nrf2的ICR小鼠为实验动物，根据前期建立的非酒精性脂肪肝模型的方法，采用高脂饲料配方建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，采用免疫组化法研究非酒精性脂肪肝模型鼠肝细胞中Nrf2与CYP2A5的表达关系以及敲除Nrf2基因对非酒精性脂肪肝病条件下CYP2A5表达的调控作用。将实验动物随机分为野生型高脂组（WT-HFD）、野生型对照组（WT-ND）、Nrf2敲除高脂组（KO-HFD）和Nrf2敲除对照组（KO-ND），分别饲喂高脂饲料或普通标准饲料。分别在4、6、8周剖杀部分小鼠，根据小鼠的血清生化指标、肝指数、肝脏病理组织学变化等指标评价模型鼠随疾病进程的发展而发生的变化。比较KO-HFD小鼠与WT-HFD小鼠疾病进程，分析Nrf2对疾病的影响。采用免疫组化方法分析野生型小鼠和Nrf2基因敲除鼠肝脏中CYP2A5的表达量随疾病进程发展发生变化以及Nrf2对CYP2A5表达的影响。研究结果表明：（1）采用高脂饲料连续饲喂8周，小鼠血清生化指标和脂质发生明显的改变。其中血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷酰转肽酶（GGT）、总胆固醇(T-Chol)、低密度脂蛋白(LDL)和葡糖糖（GLU）均呈升高趋势；但甘油三酯(TG)为降低趋势。WT-HFD和KO-HFD小鼠血清中ALT、AST与T-Chol，与各自对照组相比，极显著升高。在4、6、8周时，KO-HFD小鼠的血清中ALT、AST、T-Chol及GLU含量要显著高于WT-HFD小鼠。可见Nrf2对NAFLD疾病发展有明显影响。KO-HFD小鼠ALT和T-Chol含量，8周显著高于4周，总体呈升高趋势。WT-HFD小鼠T-Chol含量，8周时显著高于4、6周。（2）病理组织学结果显示，4-8周时与各自对照组相比，KO-HFD小鼠和WT-HFD小鼠肝组织出现显著的脂肪变性，以中央静脉周围为主，多为大、小泡混合型脂肪变性，可见炎性细胞浸润。在6-8周时KO-HFD小鼠脂肪变性和炎症活动显著高于WT-HFD小鼠。8周时，相比WT-ND小鼠，KO-ND小鼠肝脏中有脂肪颗粒，但不显著。提示Nrf2与非酒精性脂肪肝的发病机制有关系，Nrf2可能保护肝脏降低NAFLD中脂肪变性程度；敲除Nrf2会影响小鼠脂质代谢。8周的WT-HFD小鼠肝脏脂肪变性程度极显著大于4、6周WT-HFD小鼠，而4与6周WT-HFD鼠的脂肪变性程度差异不显著；4-8周各组KO-HFD小鼠的肝脏脂肪变性程度差异极显著。4-8周时，WT-HFD各组肝脏炎症活动度差异显著；KO-HFD小鼠肝脏炎症活动度8周时显著高于6周，且8、6周极显著高于4周。（3）相比WT-ND小鼠，WT-HFD小鼠肝脏中Nrf2和CYP2A5表达量极显著升高。4-8周，WT-HFD各组小鼠肝脏中Nrf2表达量呈极显著的升高；4-8周，WT-HFD各组小鼠肝脏中CYP2A5表达呈显著上升，Nrf2与CYP2A5的表达呈正相关性。（4）4-8周时，KO-ND小鼠肝脏中CYP2A5的表达低于WT-ND小鼠，但差异不显著；4-8周时，KO-HFD小鼠肝脏中CYP2A5的表达量极显著低于WT-HFD小鼠。在Nrf2敲除小鼠中没有检测到Nrf2的阳性表达。提示抑制Nrf2表达，CYP2A5的表达量降低，Nrf2在非酒精性脂肪肝中调控CYP2A5的表达；相比于KO-ND，KO-HFD小鼠中CYP2A5表达量略有升高，但不显著，提示CYP2A5的调控还可能涉及除Nrf2以外的其他转录或调节因子。本试验在成功建立小鼠NAFLD模型的基础上，旨在检测各组小鼠肝脏组织中Nrf2和CYP2A5的表达情况，研究NAFLD模型小鼠肝脏组织的Nrf2和CYP2A5的相互关系，以及可能引起这些变化的因素，如脂肪酸蓄积、脂肪变性和炎症等，从而探讨Nrf2和CYP2A5在NAFLD发生发展中的相互作用机制。同时为NAFLD新药的研制和开发提供新的线索。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
1 引言  13-23
  1.1 非酒精性脂肪肝疾病模型研究进展  13-15
    1.1.1 造模方法  13-14
    1.1.2 动物品种选择  14-15
  1.2 Nrf2 的研究进展  15-17
    1.2.1 Nrf2 抵抗氧化应激的作用  16
    1.2.2 Nrf2 在非酒精性脂肪肝疾病中的作用  16-17
    1.2.3 应用免疫组化检测 Nrf2 表达  17
  1.3 CYP2A5 的研究进展  17-21
    1.3.1 CYP2A5 表达的特点  17-18
    1.3.2 CYP2A5 表达的调节机制  18-21
    1.3.3 结语  21
  1.4 吡唑诱导 Nrf2 与 CYP2A5 研究进展  21
  1.5 研究的目的意义与研究内容  21-23
2 材料与方法  23-28
  2.1 试验材料  23-25
    2.1.1 试验动物  23
    2.1.2 主要药品试剂  23-24
    2.1.3 溶液配置  24
    2.1.4 主要仪器  24-25
  2.2 试验方法  25-28
    2.2.1 高脂饲料制作  25
    2.2.2 动物分组与处理  25
    2.2.3 血液学指标的检测方法  25-26
    2.2.4 病理学检测方法  26
    2.2.5 免疫组化法检测肝脏 Nrf2 的表达  26-27
    2.2.6 免疫组化法检测肝脏 CYP2A5 的表达  27
    2.2.7 数据处理  27-28
3 结果与分析  28-44
  3.1 小鼠一般指标检测  28-30
    3.1.1 高脂饲料对小鼠体重和肝湿重的影响  28-29
    3.1.2 高脂饲料对小鼠肝指数变化  29-30
  3.2 血清生化指标  30-34
    3.2.1 高脂饲料对小鼠血清中酶学指标的影响  30-32
    3.2.2 高脂饲料对小鼠血清中脂质和血糖的影响  32-34
  3.3 病理学观察  34-39
    3.3.1 高脂饲料对肝脏眼观的影响  34-35
    3.3.2 高脂对小鼠肝脏组织学变化的影响  35-37
    3.3.3 高脂对肝脏脂肪变性和炎症的影响  37-39
  3.4 免疫组化检测肝脏中 Nrf2 表达  39-40
    3.4.1 野生型小鼠肝脏细胞浆中 Nrf2 表达  39
    3.4.2 野生型小鼠肝脏细胞核中 Nrf2 表达  39-40
    3.4.3 Nrf2 敲除小鼠肝脏细胞中 Nrf2 表达  40
  3.5 免疫组化检测肝脏中 CYP2A5 表达  40-44
    3.5.1 野生型小鼠肝脏中 CYP2A5 的表达  40-41
    3.5.2 Nrf2 敲除小鼠肝脏中 CYP2A5 的表达  41-44
4 讨论  44-49
  4.1 非酒精性脂肪肝模型建立  44-46
    4.1.1 高脂对小鼠一般病理变化的影响  44
    4.1.2 高脂对小鼠血清中生化指标的影响  44-45
    4.1.3 高脂对小鼠肝脏病理学变化的影响  45-46
  4.2 Nrf2 在非酒精性脂肪肝发病机制中的作用  46-47
  4.3 CYP2A5 在非酒精性脂肪肝发病机制中的作用  47-48
  4.4 Nrf2 与 CYP2A5 在非酒精性脂肪肝中的作用关系  48-49
5 结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-57
攻读硕士学位期间发表的学术论文  57

小鼠NAFLD模型建立及Nrf2缺失对肝脏中CYP2A5表达的影响

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