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甘草酸、柚皮苷单克隆抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

作　者: 张越
导　师: 赵琰
学　校: 北京中医药大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 甘草酸 柚皮苷 单克隆抗体 酶联免疫吸附分析法(ELISA) 间接竞争ELISA
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究目的：制备两种重要的中药活性成分　——甘草酸和柚皮苷的单克隆抗体,基于这两种单克隆抗体建立免疫分析方法,并对其进行方法学考察。为含有甘草酸和柚皮苷的药物及复方的质量控制、体内过程等研究提供一种新的技术手段。研究方法：采用改进的高碘酸钠氧化法,制备人工免疫原GA-BSA、NAR-BSA和人工包被原GA-OVA、NAR-OVA,用紫外分光光度法对以上合成的产物进行鉴定。用合成的人工免疫原分别免疫BALB/C小鼠,每只100μg与等体积弗氏佐剂乳化均匀后背部皮下多点和腹腔注射,每隔两周加强免疫一次,以充分诱导小鼠的免疫应答。三次免疫后尾尖取血,间接ELISA检测抗血清的效价,评价免疫效果；间接竞争ELISA检测抗血清的特异性。取免疫后小鼠的脾脏制备脾单细胞悬液,PEG法与SP2/0细胞融合,筛选分泌所需抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法单克隆化获得单克隆细胞株,采用体内腹水诱生法大量生产抗体。基于单克隆抗体建立间接竞争ELISA方法,考察该方法的特异性、灵敏度、交叉反应率、回收率等相关指标,并将其用于药材、复方和生物样品的测定。结果：(1)采用改进的高碘酸钠氧化法,制备人工免疫抗原GA-BSA、NAR-BSA和人工包被抗原GA-OVA、NAR-OVA,经紫外分光光度法鉴定,以上合成的产物均偶联成功,偶联比在14.2：1-23.9：1之间。(2)使用GA-BSA免疫Balb/C小鼠,以GA-OVA作为包被抗原,间接ELISA法对免疫五次后的小鼠血清效价和特异性进行检测,结果显示免疫小鼠血清效价均在1：12800以上,且可作出竞争抑制曲线显示对甘草酸具有特异性。使用NAR-BSA免疫Balb/C小鼠,以NAR-OVA作为包被抗原,间接ELISA法对免疫五次后的小鼠血清效价和特异性进行检测,结果显示免疫小鼠血清效价均在1：6400以上,且可作出竞争抑制曲线显示对柚皮苷特异性。(3)取GA-BSA免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,单克隆化,最终获得稳定分泌抗甘草酸抗体的杂交瘤细胞株,命名为GA-Mab-DF5并采用腹水法大量生产单抗。取NAR-BSA免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合,单克隆化,最终获得稳定分泌抗甘草酸抗体的杂交瘤细胞株,命名为NAR-Mab-AB6并采用腹水法大量制备腹水单抗。(4)应用制备的腹水单抗GA-Mab-DF5,建立间接竞争ELISA法,并对其反应条件进行了优化。在甘草酸1-256μg/ml范围内,包被原GA-OVA1:2000稀释,纯化腹水1：10000稀释下,得到GA-Mab-DF5的抑制率与线性关系曲线,计算显示线性范围为4-64μg/ml,回归方程为y=-0.31n(x)+1.3594,R2=0.9986.灵敏度以IC50计,求出甘草酸标准溶液浓度为17.14μg/ml,最低检测限以IC10计,计算出对应甘草酸标准溶液浓度应为4.59μg/ml。应用制备的腹水单抗NAR-Mab-AB6,建立间接竞争ELISA法,并对其反应条件进行了优化。在柚皮苷1-450ng/ml范围内,包被原NAR-OVA1:2000稀释,腹水1：4000稀释条件下,]MAR-Mab-AB6的抑制率与线性关系曲线,线性范围为14-225ng/ml回归方程为y=-0.4111n(x)+2.5018,R2=0.998.灵敏度以IC50计,求出对应的柚皮苷标准溶液浓度为84.45ng/ml,最低检测限以IC10计,计算出对应柚皮苷标准溶液浓度应为19.70ng/ml。(5)通过间接竞争ELISA(?)检测单抗与甘草酸及其它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示与甘草次酸交叉反应率为31.55%,与其他成分的交叉反应率均小于0.09%。表明本研究得到的抗甘草酸单抗对甘草酸有很好的特异性。通过问接竞争ELISA法检测单抗与柚皮苷及其它中药活性成分反应的交叉反应率。结果显示在二十余种化合物和四十余种中药粗提物中与除葛根素、芦丁、大黄酸、葛根提取物、大戟提取物有较强交叉反应外,其余均无交叉反应。表明本研究得到的抗柚皮苷单抗对柚皮苷有较好的特异性。

全文目录


目录  4-5
英文缩略语表  5-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
1 文献综述  11-17
  1.1 甘草与甘草酸  11-12
  1.2 甘草酸常用的分析方法  12
  1.3 柚皮苷综述  12-15
  1.4 中药活性成分常用分析方法  15
  1.5 免疫分析技术在中药领域的应用  15-17
2 前言  17-19
3 甘草酸单克隆抗体制备及免疫分析方法建立  19-41
  3.1 实验材料  19-22
  3.2 实验方法  22-29
  3.3 实验结果  29-37
  3.4 讨论  37-41
4 柚皮苷单克隆抗体的制备及免疫分析方法的建立  41-59
  4.1 实验材料  41
  4.2 实验方法  41-44
  4.3 实验结果  44-53
  4.4 讨论  53-59
5 结论与展望  59-61
6 参考文献  61-67
致谢  67-68
个人简历  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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