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绵羊肺腺瘤病毒CA基因的克隆表达及间接竞争ELISA方法的建立

作　者: 付丽君
导　师: 宋铭忻
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 绵羊肺腺瘤病绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白间接竞争ELISA 临床应用
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

绵羊肺腺瘤病（OPA）是由外源性的绵羊肺腺瘤病毒（exJSRV）引起的羊肺脏和支气管上皮细胞的癌变，该病的特征性症状是在肺部产生大量的泡沫状液体，当羊低头或“小推车”试验时液体从鼻孔流出，羊一旦出现该临床症状后会在数日内死亡或在运动、寒冷刺激后突然死亡。OPA早在19世纪早期就已发现，发病年龄为2月龄-11岁龄（以2-4岁龄为主），对种羊危害极为严重，目前尚无有效阻止该病传播的方法，给许多国家的绵羊养殖业造成了重大损失。感染OPA的羊体内检测不出针对JSRV的循环抗体或T淋巴细胞应答，使得OPA检测只能限定在抗原检测上，然而至今国内外范围内都未发现能让该病毒在体外高效稳定表达的细胞系，也未分离出JSRV的纯病毒，这给该病的实验室诊断、疫苗及特异性药物的研制造成了极大的困难，也给JSRV分子生物学特性的进一步研究造成了困难。OPA不仅是重要的兽医学问题，也为上皮细胞瘤（如人类的肺癌）以及HIV的分子生物学研究提供了新的模型，因此建立一种准确、简便的诊断方法来对该病作出准确诊断具有积极的研究意义。本研究根据JSRV衣壳蛋白（CA）基因序列设计特异性引物，以OPA自然感染的绵羊肺脏总DNA为模板进行PCR扩增，随后克隆至pEASY载体中，经测序正确后与pET28a质粒连接构建重组表达质粒6CA66028a1，对测序正确的阳性表达质粒用IPTG诱导，经SDS-PAGE分析正确后，优化表达条件并进行大量诱导和纯化，用纯化后的重组CA蛋白作为包被抗原，用从羊肺脏组织和血液中提取的病毒与其竞争重组蛋白制备的兔免疫血清，初步建立了间接竞争ELISA方法并对该方法进行优化确定最佳反应条件。原核表达结果显示，当IPTG终浓度为0.4mmol/L，诱导温度为30℃，诱导时间为5h重组蛋白表达量最大，重组蛋白分子量约为28kDa，主要以上清形式表达，重组蛋白免疫所得兔免血清为国内首段能与天然JSRV结合的抗CA段完整重组蛋白，为进一步建立JSRV的ELISA方法奠定了基础；竞争ELISA结果显示，当抗原包被浓度为2μg/ml，一抗稀释度为1:2000，以1%BSA（PBST）作为封闭液封闭1h，一抗和病毒混合45min，包被蛋白与一抗混合液竞争40min，二抗稀释度为1:1600，二抗孵育45min，TMB显色12min为最优。本研究初步在实验室建立了JSRV的竞争ELISA检测方法。为了解黑龙江的澳大利亚进口绵羊、黑龙江省内及与黑龙江毗邻的内蒙地区OPA感染情况，及初步建立好的间接竞争ELISA方法实际临床使用价值，本研究对23只黑龙江澳大利亚进口绵羊、黑龙江省9个地区的90个样本及与黑龙江毗邻的内蒙地区的120个样本进行检测。结果表明：肺脏样品阳性率为61.11%，其中内蒙和齐齐哈尔地区的感染率分别为45.71%和46%；血清样品阳性率为40.83%，其中内蒙地区与黑龙江地区的感染率分别为52%和37.5%，黑龙江地区以西南部地区感染率较高，东部地区（鹤岗、鸡东、佳木斯）及澳大利亚进口羊未检出感染病例，结果符合实际情况，说明该ELISA检测方法具有一定可行性。

全文目录

摘要  9-10
Abstract  10-12
1 前言  12-18
  1.1 流行病学  12
  1.2 临床症状  12
  1.3 OPA 的病理解剖学变化  12-13
    1.3.1 非典型 OPA 病例解剖学变化  12-13
    1.3.2 典型 OPA 病例解剖学变化  13
  1.4 JSRV 致病原的鉴定  13
  1.5 JSRV 基因组  13-15
  1.6 JSRV 的复制  15
  1.7 内源性 JSRV  15-16
  1.8 JSRV 的嗜组织性  16
  1.9 致瘤机理  16
  1.10 JSRV 检测方法的研究进展  16-17
  1.11 研究的目的与意义  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 病毒、微生物材料及待检样品来源  18
    2.1.2 菌株和载体  18
    2.1.3 主要试剂  18-19
    2.1.4 主要试剂配制  19-20
    2.1.5 仪器设备  20-21
    2.1.6 主要软件及网络资源  21
  2.2 试验方法  21-30
    2.2.1 病料组织 DNA 的提取  21
    2.2.2 引物设计  21
    2.2.3 CA 基因的克隆  21-23
    2.2.4 重组表达质粒的构建  23-25
    2.2.5 重组蛋白 6CA66028a1 的表达  25
    2.2.6 表达条件的优化  25-26
    2.2.7 重组蛋白 6CA66028a1 的大量表达与纯化  26
    2.2.8 重组蛋白 6CA66028a1 的 western blot 印迹  26
    2.2.9 动物的免疫  26-27
    2.2.10 多抗的纯化  27
    2.2.11 多抗的 western blot 印迹  27-28
    2.2.12 抗原、封闭液、一抗、二抗间交叉反应的测定  28
    2.2.13 最佳抗原及抗体工作浓度的确定  28
    2.2.14 间接竞争 ELISA 测定的基本实验步骤  28-29
    2.2.15 间接竞争 ELISA 条件的优化  29-30
3 结果  30-53
  3.1 CA 基因的 PCR 扩增  30
  3.2 重组克隆质粒 DNA 的鉴定  30-31
  3.3 重组表达质粒 DNA 的鉴定  31
  3.4 不同株 CA 基因序列、氨基酸序列及同源性分析  31-36
    3.4.1 6CA66028a1 与各株基因序列比对结果  31-34
    3.4.2 6CA66028a1 与各株氨基酸序列比对结果  34-36
  3.5 跨膜结构分析  36
  3.6 信号肽位点分析  36-37
  3.7 二级结构分析  37-38
  3.8 衣壳蛋白分子进化树  38-39
  3.9 重组蛋白的表达  39-40
  3.10 重组蛋白表达条件的优化及纯化  40-42
  3.11 重组蛋白与抗 HIS 标签单抗的 WESTERN BLOT 结果  42
  3.12 多抗的纯化  42-43
  3.13 多抗与重组蛋白及绵羊肺腺瘤病毒的 WESTERN BLOT 结果  43-44
  3.14 抗原、封闭液、一抗、二抗间交叉反应的测定结果  44
  3.15 重组抗原和抗体最佳浓度  44-45
  3.16 封闭液的优化  45-46
  3.17 封闭时间的优化  46-47
  3.18 一抗和病毒混合时间的优化  47-48
  3.19 病毒与包被蛋白竞争混合液中的一抗的时间优化  48
  3.20 二抗浓度的优化  48-49
  3.21 二抗孵育时间的优化  49
  3.22 显色时间的优化  49-50
  3.23 交叉反应结果  50
  3.24 重复性试验  50
  3.25 绵羊肺腺瘤病 ELISA 检测及竞争 ELISA 阳性值标准的确定  50-53
4 讨论  53-55
  4.1 原核表达体系的构建  53
  4.2 抗体的验证  53
  4.3 ELISA 方法的建立  53-55
5 结论  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-60
攻读硕士学位期间发表的学术论文  60

绵羊肺腺瘤病毒CA基因的克隆表达及间接竞争ELISA方法的建立

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