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CpG ODNs在水产养殖甲壳类动物中免疫增强作用机制及其应用的初步研究

作　者: 孙瑞
导　师: 宋林生
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 凡纳滨对虾中华绒螯蟹 CpG ODNs 免疫防治
分类号: S963
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
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内容摘要

近年来，水产养殖甲壳类病害的频发给人们的生产和生活造成巨大损失。开发和利用新型免疫增强剂可以为病害防治带来新的思路。CpG ODNs（CpGoligodeoxynucleotides），是一类含有未甲基化的CpG基序并具有免疫激活能力的寡聚核苷酸，属于一种新型的免疫增强剂。本研究着重探讨了CpG ODNs在虾、蟹等甲壳类动物中的免疫增强作用机制以及在甲壳类养殖业中大规模应用的可能性。通过用CpG ODN2395体外处理凡纳滨对虾的血细胞，我们发现其能够显著增强血细胞中TNF-α的活力，并且上调NO的水平；同时，在凡纳滨对虾中发现Toll样受体LvTLR1和LvTLR3具有结合CpG ODN2395的能力。根据氯喹抑制实验，发现抑制内体酸化后由CpG ODN2395刺激所引起的TNF-α和NO的变化均消失。结合激光共聚焦显微镜对CpG ODN2395的入胞情况的观测，结果表明内体的成熟是CpG ODNs与LvTLRs识别并结合的关键环节。因此，可以推测，CpG ODNs所诱发的免疫效应可能是由Toll信号通路所介导和激活的。本研究利用凡纳滨对虾对CpG ODNs的免疫增强效果进行评价。研究表明，具有多CpG模体串联结构的CpG ODNs在调节凡纳滨对虾血细胞稳态和免疫力等方面有着重要作用。CpG ODNs可以通过提升细胞凋亡水平和新生循环细胞数目来调节血细胞稳态。与此同时，它还能够促进血细胞的吞噬能力和机体活性氧水平上升。通过投喂实验来探讨CpG ODNs在甲壳类动物养殖中的应用前景。研究表明，投喂CpG ODNs添加饲料后，中华绒螯蟹的溶菌酶和过氧化氢酶活力显著上升；并且攻毒后，能比较有效的保护中华绒螯蟹免受病原体的侵染。同时，投喂CpG ODNs添加饲料的中华绒鳌蟹的相对增重率显著升高。通过定位实验，发现CpG ODNs可以被细胞以膜泡依赖的内吞过程所内化，并最终定位于溶酶体。综上所述，作为一种新型的免疫增强剂，CpG ODNs可能通过细胞内化过程，激活Toll信号通路，进而激活虾、蟹类的固有免疫系统。饲料添加CpG ODNs是一种可行且有效的利用途径，可以大规模推广使用。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-28
  第一节重要水产养殖甲壳类动物的病害防治  12-20
    一、重要水产养殖甲壳类动物的养殖现状及其主要病害  12-15
      1、重要水产养殖甲壳类动物的养殖现状  12-13
      2、重要水产养殖甲壳类动物的主要病害  13-15
    二、重要水产养殖甲壳类动物的病害防治  15-20
      1、甲壳类动物免疫防御机制的研究进展  15-19
      2、重要水产养殖甲壳类动物的主要病害防治措施  19-20
  第二节免疫增强剂CpG ODNs的研究概况  20-27
    一、 CpG ODNs概况  20-21
      1、 CpG ODNs的发现  20
      2、 CpG ODNs的结构特征  20-21
    二、 CpG ODNs在高等动物中的作用机制和应用研究  21-25
      1、 CpG ODNs在脊椎动物中的作用机制  21-24
      2、 CpG ODNs在脊椎动物中的应用研究  24-25
    三、 CpG ODNs在重要水产养殖甲壳类动物中的研究进展  25-27
  第三节本研究的目的及意义  27-28
第二章实验材料及方法  28-46
  第一节实验材料  28-30
    一、实验动物、菌株和细胞  28
    二、实验用CpG ODNs的合成及鉴定  28-29
      1、用于个体实验的CpG ODNs的合成及鉴定  28-29
      2、用于细胞实验的CpG ODNs的合成及鉴定  29
    三、主要的培养基和缓冲液  29
    四、主要化学试剂  29-30
    五、主要仪器设备  30
  第二节实验方法  30-46
    一、基因克隆及序列分析  30-32
    二、重组载体的构建  32-33
    三、蛋白质的原核重组表达、纯化及复性  33-34
    四、 Western Blot  34-36
    五、酶联免疫吸附实验（ELISA）  36-37
    六、凡纳滨对虾血细胞原代培养及刺激  37-38
    七、亚细胞定位分析  38
    八、 TNF-α的活性检测  38-39
    九、 NO的含量检测  39
    十、双荧光系统报告基因检测实验  39-40
    十一、凡纳滨对虾血细胞总数检测  40
    十二、凡纳滨对虾新生循环血细胞数目的检测  40-41
    十三、凡纳滨对虾血细胞吞噬能力的检测  41-42
    十四、凡纳滨对虾血细胞凋亡比率检测  42-43
    十五、凡纳滨对虾血细胞ROS水平的检测  43
    十六、过氧化氢酶的活力检测  43-44
    十七、溶菌酶的活力检测  44-46
第三章实验结果  46-66
  第一节 CpG ODNs免疫增强机制的探讨  46-59
    一、 CpG ODNs诱发的免疫学效应及其细胞生物学特征  46-50
      1、 CpG ODNs处理后凡纳滨对虾原代血细胞中TNF-α活力的变化  46
      2、 CpG ODNs处理后凡纳滨对虾原代血细胞NO水平的变化  46-47
      3、 CpG ODNs和氯喹处理后凡纳滨对虾原代血细胞中TNF-α活力的变化  47-48
      4、 CpG ODNs和氯喹处理后凡纳滨对虾原代血细胞NO水平的变化  48-49
      5、 CpG ODNs在凡纳滨对虾血细胞中的亚细胞定位  49-50
    二、 CpG ODNs的免疫识别  50-54
      1、凡纳滨对虾LvTLRs-ECD的序列分析  50-52
      2、凡纳滨对虾LvTLRs-ECD与CpG ODNs的结合活性  52-54
    三、 CpG ODNs免疫增强效果的评价  54-59
      1、 CpG ODNs对凡纳滨对虾血细胞总数的影响  54-55
      2、 CpG ODNs对凡纳滨对虾血细胞凋亡水平的影响  55-56
      3、 CpG ODNs对凡纳滨对虾新生循环血细胞数目的影响  56-57
      4、 CpG ODNs对凡纳滨对虾血细胞吞噬能力的影响  57-58
      5、 CpG ODNs对凡纳滨对虾血细胞ROS水平的影响  58-59
  第二节 CpG ODNs在甲壳类动物养殖中的初步应用  59-66
    一、 CpG ODNs对中华绒螯蟹生长指标的影响  59-60
    二、 CpG ODNs对中华绒螯蟹溶菌酶活力的影响  60-61
    三、 CpG ODNs对中华绒螯蟹过氧化氢酶活力的影响  61-62
    四、 CpG ODNs对中华绒螯蟹抗病力的影响  62-63
    五、 CpG ODNs入胞机制及其细胞定位的探讨  63-66
第四章分析与讨论  66-73
  第一节 CpG ODNs的免疫增强作用与TLR信号通路相关  66-68
  第二节 CpG ODNs可以调控凡纳滨对虾血细胞稳态及免疫力  68-70
  第三节 CpG ODNs在甲壳类动物养殖中的应用前景广阔  70-73
第五章结论  73-75
第六章硕士在读期间完成的其他工作  75-86
  第一节研究背景  75-76
  第二节实验方法  76-77
  第三节实验结果  77-83
  第四节讨论  83-86
参考文献  86-97
作者简历及硕士在读期间完成和发表的论文  97

CpG ODNs在水产养殖甲壳类动物中免疫增强作用机制及其应用的初步研究

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