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尼罗罗非鱼血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 梁筱燕
导　师: 张小萍
学　校: 西南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 罗非鱼 免疫球蛋白 单克隆抗体
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为我国重要的经济鱼类。近年来,随着养殖规模的不断扩大,高密度养殖和水体污染导致鱼类疾病的大规模暴发,给渔民造成了巨大的经济损失。采用鱼塘消毒或者抗生素治疗可以在一定程度上缓解病害,但是不能从根本上解决问题,还可能会由于抗生素在鱼体内的残存造成环境污染。要想从根本上防治鱼病,研究鱼类的免疫应答至关重要。鱼类具有比较完善的免疫系统,免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)参与鱼类体液免疫并发挥重要作用,因此对罗非鱼Ig进行研究有助于揭开罗非负免疫应答规律,为罗非鱼疾病的防治提供理论基础。单克隆抗体由于其特异性强、灵敏度高和均一性好的优点,被广泛应用于多个领域,近年来也被应用于鱼类免疫学研究当中。在对罗非鱼Ig进行研究的过程中,抗罗非鱼Ig特异性单克隆抗体无疑是一个强有力的工具,而获得高纯度的Ig是成功制备罗非鱼Ig单克隆抗体的前提。因此,本研究首先纯化罗非鱼血清Ig并对其理化性质进行初步鉴定,然后制备鼠抗罗非鱼Ig单克隆抗体并对其特性进行研究,最后应用制备的抗体检测了嗜水气单孢菌免疫后罗非鱼的免疫应答规律。具体研究结果如下：1.采用Sepharose-4B凝胶层析、MBP亲和层析、Protein A亲和层析和辛酸-硫酸铵沉淀法纯化罗非鱼血清Ig。SDS-PAGE结果表明：Protein A亲和层析法能成功纯化罗非鱼血清Ig,Ig重链相对分子量约为76.6kDa,轻链相对分子量约为28.5kDa。MBP亲和层析、Sepharose-4B凝胶层析、辛酸-硫酸铵沉淀法均不适用于纯化罗非鱼血清Ig。纯化蛋白经Nanosep Centrifugal Devices柱离心浓缩后,BCA蛋白定量结果表明：罗非鱼全血清2mL经Protein A亲和层析纯化蛋白浓度为0.85mg/mL,体积100μL,质量为85ug,较其它鱼而言,纯化产率较低。2.以纯化岁非鱼Ig为抗原.免疫Balb/c小鼠.采用单克隆抗体技术经细胞融合、间接ELISA筛选和有限稀释法亚克隆成功制备了5株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为T7-B7、T5-E2、T8-G3、T9-D4、T3-D9、ELISA检测抗体识别表位性质结果表明,T3-D9识别的是线性表位,而剩余4株抗体识别的是构象依赖性表位；利用Western-blotting检测单克隆抗体特性结果表明,单抗T8-G3、 T7-B7和T9-D4均识别罗非鱼Ig轻链,T3-D9识别罗非鱼Ig重链,T5-E2反应呈阴性。利用叠加ELISA分析T8-G3、T9-D4、T3-D9三株单抗识别表位的异同,结果表明,T8-G3和T9-D4识别相同或相近的抗原表位,T8-G3/T9-D4与T3-D9识别不同的表位。ELISA检测抗体特异性结果表明,T3-D9与鲈鱼、南方鲶、斑点叉尾鯝、胭脂鱼血清均无交叉反应,T8-G3、T7-B7和T9-D4与鲈鱼血清有较弱的交叉反应。3.应用制备的杂交瘤(T3-D9)上清探究罗非鱼抗嗜水气单孢菌特异抗体的动力学特征。本实验共免疫三组健康罗非鱼,A组鱼直接注射菌液,B组混合佐剂注射,C组注射PBS作为对照组。结果表明,应用鼠抗罗非鱼Ig单克隆抗体可以监测免疫鱼的应答反应,AB两组鱼均产生免疫应答,A组鱼抗体效价较低,仅能达到1：500,B组鱼效价较高,能达到1：16000。两组鱼的抗体水平变化趋势相同,免疫两次后第21天A组鱼的抗体水平为1：500,B组鱼达到1：8000,随后开始下降,到28天两组鱼抗体水平均仅为21天的一半;第28天进行第三次免疫后两组鱼的抗体水平又逐渐上升,第35天分别为1：500和1：8000；B组鱼在第49天达到1：16000,而A组鱼在第42天用混合弗氏完全佐剂的菌液加强免疫一次后,抗体水平明显上升,在第55天达到1：2000。本研究通过比较四种纯化方法的效果确定纯化罗非鱼Ig的有效方法,为罗非鱼Ig的纯化提供理论基础。在纯化Ig的基础上,本研究成功制备了鼠抗罗非鱼Ig单克隆抗体,该抗体可用于罗非鱼免疫应答规律的研究,为今后继续研究罗非鱼免疫系统提供了工具。

全文目录


目录  3-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章 文献综述  10-18
  1.1 尼罗罗非鱼研究现状  10-11
    1.1.1 尼罗罗非鱼生长动力学研究  10
    1.1.2 尼罗罗非鱼常见疾病及防治  10-11
  1.2 硬骨鱼免疫系统研究概况  11-15
    1.2.1 硬骨鱼免疫系统概述  11-12
    1.2.2 硬骨鱼免疫球蛋白分子结构  12
    1.2.3 硬骨鱼免疫球蛋白种类  12-14
    1.2.4 免疫球蛋白多样性产生机制  14-15
  1.3 单克隆抗体在鱼类免疫学研究中的应用  15-18
    1.3.1 单克隆抗体在淋巴细胞研究中的应用  15-16
    1.3.2 单克隆抗体在免疫球蛋白研究中的应用  16
    1.3.3 单克隆抗体在免疫球蛋白检测中的应用  16
    1.3.4 单克隆抗体在鱼类疾病防治中的应用  16-18
第二章 绪论  18-20
  2.1 选题背景及意义  18
  2.2 研究目的和研究内容  18-20
    2.2.1 研究目的  18-19
    2.2.2 主要研究内容  19-20
第三章 罗非鱼血清免疫球蛋白的纯化及理化性质初步鉴定  20-28
  3.1 引言  20
  3.2 材料和方法  20-24
    3.2.1 实验材料  20-21
    3.2.2 尼罗罗非鱼血清制备  21
    3.2.3 Protein A亲和层析纯化罗非鱼血清Ig  21
    3.2.4 MBP亲和层析纯化罗非鱼血清Ig  21
    3.2.5 Sepharose-4B凝胶层析纯化罗非鱼血清Ig  21-22
    3.2.6 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化罗非鱼血清Ig  22-23
    3.2.7 SDS-PAGE检测蛋白纯度  23-24
    3.2.8 蛋白含量测定  24
  3.3 实验结果  24-25
    3.3.1 SDS-PAGE检测四种纯化方法结果  24-25
    3.3.2 纯化产物蛋白质含量测定结果  25
  3.4 讨论  25-28
    3.4.1 Protein A亲和层析纯化罗非鱼血清Ig  25-26
    3.4.2 MBP亲和层析纯化罗非鱼血清Ig  26
    3.4.3 Sepharose-4B凝胶层析纯化罗非鱼血清Ig  26
    3.4.4 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化罗非鱼血清Ig  26-28
第四章 鼠抗罗非鱼血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备及特性分析  28-40
  4.1 引言  28
  4.2 实验材料  28-29
    4.2.1 实验动物  28
    4.2.2 主要试剂和仪器  28-29
  4.3 实验方法  29-33
    4.3.1 小鼠免疫  29
    4.3.2 抗血清效价检测  29
    4.3.3 骨髓瘤细胞的复苏和培养  29
    4.3.4 饲养细胞的制备  29-30
    4.3.5 细胞融合  30
    4.3.6 阳性杂交瘤细胞初筛  30-31
    4.3.7 亚克隆阳性杂交瘤细胞  31
    4.3.8 阳性杂交瘤细胞的冻存及扩大培养  31
    4.3.9 罗非鱼嗜水气单孢菌免疫及免疫血清收集  31
    4.3.10 单克隆抗体识别表位性质分析  31
    4.3.11 Western-blotting分析  31-32
    4.3.12 ELISA检测单克隆抗体特异性  32
    4.3.13 叠加ELISA分析单抗识别表位  32-33
  4.4 实验结果  33-36
    4.4.1 免疫鼠抗血清效价检测结果  33
    4.4.2 阳性杂交瘤细胞筛选结果  33
    4.4.3 抗体识别表位性质检测结果  33-34
    4.4.4 Western-blotting检测结果  34-35
    4.4.5 单克隆抗体交叉反反应性检测结果  35
    4.4.6 单抗识别表位叠加ELISA检测结果  35-36
  4.5 讨论  36-40
    4.5.1 制备单克隆抗体的影响因素分析  36-37
    4.5.2 单抗识别抗原表位性质分析  37
    4.5.3 Western-blotting结果分析  37-38
    4.5.4 单抗识别表位叠加ELISA结果分析  38
    4.5.5 单抗特异性ELISA结果分析  38-40
第五章 鼠抗罗非鱼血清免疫球蛋白单克隆抗体的应用  40-46
  5.1 引言  40
  5.2 实验材料和仪器  40
    5.2.1 实验材料  40
    5.2.2 主要试剂和仪器  40
  5.3 实验方法  40-42
    5.3.1 嗜水气单孢菌疫苗制备  40-41
    5.3.2 罗非鱼免疫  41-42
    5.3.3 双抗夹心ELISA检测免疫鱼血清抗体效价  42
  5.4 实验结果  42-43
    5.4.1 嗜水气单孢菌革兰氏染色及细菌计数  42-43
    5.4.2 免疫鱼血清效价检测  43
  5.5 讨论  43-46
    5.5.1 嗜水气单孢菌的培养及灭活  43-44
    5.5.2 嗜水气单孢菌免疫后鱼体应答规律  44-46
第六章 全文结论  46-48
  6.1 全文结论  46-48
参考文献  48-56
附录  56-58
致谢  58

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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