学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

绵羊痘病毒E3蛋白对PKR调节作用的初步研究

作　者: 于少雄
导　师: 张强
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 绵羊痘病毒 E3蛋白干扰素 PKR
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

绵羊痘由绵羊痘病毒（Sheeppox virus, SPPV）引起，以在皮肤上产生特异的痘疮为特征，发生时严重影响家畜及畜产品国际贸易，是绵羊的重要疫病之一。对SPPV全基因组测序发现，第34号开放阅读框编码与痘苗病毒（Vaccinia virus，VV）E3蛋白同源的蛋白。研究表明，痘苗病毒编码的E3蛋白能够抑制干扰素系统中双链RNA依赖的蛋白激酶（Double-strandedRNA-dependent protein kinase，PKR）等抗病毒分子的活性。SPPV E3蛋白对PKR的作用尚无报道。本研究探究了SPPV的抗干扰素能力及SPPV E3蛋白对PKR介导的抗病毒信号通路的调节作用。研究内容如下：1. SPPV qPCR检测方法的建立为后续研究检测的需要，首先建立了SPPV的qPCR检测方法，检测其特异性、敏感性及重复性。结果显示，建立的qPCR检测方法特异性好（能够显著区分绵羊痘病毒和羊接触传染性脓疱性皮炎病毒），敏感性好（可检测102copies/μL的SPPV），重复性高（变异系数小于5%）。2.SPPV E3蛋白的生物信息学分析利用生物信息学软件分析SPPV E3L基因。SPPV E3L基因全长534bp，编码177位氨基酸，包括Z-alpha和DSRM两个保守的结构域；亚细胞定位预测显示，SPPV E3蛋白主要定位于细胞核和细胞质内；与VV E3蛋白相比，SPPV E3蛋白位于氨基末端的Z-alpha结构域变化较大，但位于羧基末端的DRBD结构域则较为保守，推测SPPV E3蛋白可能具有抑制PKR活化的功能。3. SPPV E3蛋白的表达、纯化与抗体制备扩增SPPV E3L基因，克隆至pGEX4T-1表达载体，以BL21（DE3）plysS宿主菌对目的蛋白进行诱导表达，获得SPPV E3蛋白；用GST结合琼脂纯化重组蛋白，用纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠，制备SPPV E3蛋白的鼠抗血清，间接ELISA测定鼠抗血清效价为1：100000，可用于后续试验中对SPPV E3蛋白的检测。4. SPPV干扰素敏感试验及SPPV E3蛋白对PKR调节作用的探究用浓度范围为0-5000U/mL的IFN-β处理Vero细胞24h,感染SPPV，培养液中加入不同浓度IFN-β，待0U/mL IFN-β处理的细胞孔完全病变时，用建立的SPPV qPCR的检测方法对病毒拷贝数进行测定，结果显示100U/mL的IFN-β即可显著地抑制SPPV的复制，表明SPPV对IFN-β敏感。用pcDNA3.1(+)-SPPV E3L质粒转染Vero细胞，48h后分别用浓度为10、20、50μg/mL的polyI:C转染细胞刺激PKR的活化，8h后用RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白进行Western-blot检测，结果显示随着polyI:C浓度的增加，细胞内PKR的磷酸化水平逐步提高，而SPPV E3蛋白的表达对这一过程无显著影响，表明SPPV E3蛋白在体外试验中不能抑制PKR的活化。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章绪论  13-21
  1.1 引言  13
  1.2 干扰素的抗病毒机制  13-15
  1.3 E3 蛋白介导的痘苗病毒抗干扰素作用机制  15-20
    1.3.1 通过抑制 PKR 活化  15-17
    1.3.2 通过阻断 dsRNA 抑制 2′,5′-OAS/RNaseL 系统的活化  17-18
    1.3.3 通过抑制 RNA 聚合酶Ⅲ介导的 dsRNA 传导通路  18
    1.3.4 通过与 ISG15 结合并抑制其修饰活性  18-19
    1.3.5 抑制 ADAR1 催化腺苷酸转化为次黄嘌呤的编辑活性  19
    1.3.6 抑制 IRF3/7 的的活化  19-20
  1.4 研究展望  20-21
第二章绵羊痘病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立  21-28
  2.1 试验材料  21
    2.1.1 毒株  21
    2.1.2 主要试剂  21
    2.1.3 仪器设备  21
  2.2 试验方法  21-23
    2.2.1 探针和引物的设计  21
    2.2.2 质粒标准品的构建  21-22
      2.2.2.1 外围引物的设计  21-22
      2.2.2.2 外围片段的 PCR 扩增  22
      2.2.2.3 外围片段的克隆  22
    2.2.3 SPPV qPCR 检测方法反应体系的建立  22
    2.2.4 qPCR 敏感性检验  22
    2.2.5 qPCR 重复性检验  22
    2.2.6 qPCR 特异性检验  22-23
  2.3 试验结果  23-26
    2.3.1 外围片段的 PCR 扩增  23
    2.3.2 外围片段的克隆及鉴定  23
    2.3.3 质粒标准品的制备  23-24
    2.3.4 SPPV qPCR 检测方法的建立  24
    2.3.5 SPPV qPCR 检测方法敏感性检验  24-25
    2.3.6 SPPV qPCR 检测方法特异性检验  25-26
    2.3.7 SPPV qPCR 检测方法重复性检验  26
  2.4 讨论  26-28
第三章绵羊痘病毒 E3 蛋白的生物信息学分析  28-35
  3.1 试验材料  28
  3.2 试验方法  28
  3.3 试验结果  28-33
    3.3.1 SPPV E3L 基因序列特征分析  28-29
    3.3.2 SPPV E3 蛋白序列特征分析  29
    3.3.3 SPPV E3 蛋白亚细胞定位分析  29
    3.3.4 SPPV E3 蛋白疏水性分析  29-30
    3.3.5 痘病毒科几种重要病原的序列分析  30-32
    3.3.6 SPPV E3 蛋白二级结构分析  32
    3.3.7 绵羊痘病毒 E3 蛋白的三级结构预测  32-33
    3.3.8 SPPV E3 蛋白稀有密码子的分析  33
  3.4 讨论  33-35
    3.4.1 SPPV E3 蛋白序列特征及 E3 同源蛋白保守性分析  33
    3.4.2 SPPV E3 蛋白的定位  33-34
    3.4.3 绵羊痘病毒 E3 蛋白表达宿主菌的选择  34-35
第四章绵羊痘病毒 E3L 基因的表达、纯化与抗体制备  35-42
  4.1 试验材料  35
    4.1.1 主要试剂  35
    4.1.2 主要仪器  35
  4.2 试验方法  35-37
    4.2.1 SPPV E3L 基因的引物设计及合成  35
    4.2.2 SPPV E3L 基因的 PCR 扩增  35-36
    4.2.3 SPPV E3L 基因的克隆与鉴定  36
    4.2.4 SPPV E3L 基因原核表达载体的构建  36
    4.2.5 SPPV E3L 基因的诱导表达  36
    4.2.6 SPPV E3 重组蛋白的抗原性分析  36-37
    4.2.7 SPPV E3 重组蛋白的可溶性分析及纯化  37
    4.2.8 重组蛋白 SPPV E3 鼠抗血清的制备及鉴定  37
  4.3 试验结果  37-41
    4.3.1 SPPV E3L 基因的扩增、T-A 克隆及鉴定  37
    4.3.2 SPPV E3L 基因的原核表达载体构建  37-39
    4.3.3 重组蛋白 SPPV E3 的诱导表达  39
    4.3.4 重组蛋白 SPPV E3 的抗原性分析  39-40
    4.3.5 重组蛋白 SPPV E3 的可溶性分析及纯化  40-41
    4.3.6 SPPV E3 蛋白鼠抗血清的制备与鉴定  41
  4.4 讨论  41-42
第五章绵羊痘病毒 E3 蛋白对 PKR 作用活性的探究  42-49
  5.1 试验材料  42-43
    5.1.1 细胞及毒株  42
    5.1.2 试剂  42
    5.1.3 试剂配制  42-43
  5.2 试验方法  43-44
    5.2.1 细胞的复苏、传代和冻存  43
    5.2.2 SPPV 干扰素敏感试验  43
    5.2.3 IFN-β对细胞内 PKR 表达水平的影响  43
    5.2.4 SPPV E3L 基因真核表达载体的构建及大量提取质粒  43-44
    5.2.5 pcDNA3.1(+)-SPPV E3L 在 Vero 细胞中的表达及检测  44
    5.2.6 瞬时表达 E3 蛋白对 polyI:C 刺激 PKR 活化中的影响  44
  5.3 试验结果  44-47
    5.3.1 绵羊痘病毒干扰素敏感试验  44-45
    5.3.2 IFN-β对细胞内 PKR 表达水平的影响  45
    5.3.3 SPPV E3L 基因真核表达载体的构建  45-46
    5.3.4 pcDNA3.1(+)-SPPV E3L 重组质粒转染至 Vero 细胞及 SPPV E3L 的真核表达  46
    5.3.5 瞬时表达 SPPV E3 蛋白对 polyI:C 刺激 PKR 活化中的影响  46-47
  5.4 讨论  47-49
    5.4.1 IFN-β能够显著地抑制 SPPV 的复制  47-48
    5.4.2 瞬时表达 SPPV E3 蛋白不能抑制 polyI:C 诱导的 PKR 活化  48-49
第六章全文总结  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56
作者简历  56

绵羊痘病毒E3蛋白对PKR调节作用的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文