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H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪CDK9和PKR基因表达的影响

作　者: 孙岩
导　师: 张德礼
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 甲型流感病毒属 CDK9基因 PKR基因 表达
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


流行性感冒是由一种急性呼吸道传染病,由流感病毒引起。甲型流感病毒属为正粘病毒科,容易发生基因重组,根据血凝素和神经氨酸酶的不同,又分为16个H亚型和9个N亚型。甲型流感病毒属中有H1N1、H2N2、H3N2和H5N1病毒曾经广泛流行,导致不同程度的感染和死亡。细胞周期依赖的蛋白激酶9（CDK9）与细胞周期蛋白组成P-TEFb复合物,可以使RNApolⅡ磷酸化。而流感病毒感染后磷酸化RNApolⅡ水平降低。双链RNA激活的蛋白激酶（PKR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,人的流感病毒感染后会抑制PKR,使真核翻译起始因子-2（ eIF-2）不能发生磷酸化,有助于蛋白合成和病毒复制。为研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪CDK9和PKR基因表达的影响,揭示流感发病机制与两基因的相关性。本研究利用实时荧光定量PCR技术和免疫组化半定量法检测H3N2和H1N1甲型流感病毒感染168 h后猪肺脏组织内CDK9和PKR的mRNA和蛋白表达变化。具体研究内容与结果如下:1、成功构建H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪动物模型。肺脏组织病理变化:终末细支气管单层纤毛柱状上皮细胞严重脱落,且终末细支气管周围肺泡隔增厚,肺泡腔缩小,甚至消失。2、经实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪168 h后肺脏组织内CDK9基因mRNA表达量明显降低。经免疫组化半定量法鉴定流感病毒感染后CDK9蛋白较正常组织蛋白表达水平低。3、经实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪168 h后肺脏组织内PKR基因mRNA表达量明显降低。经免疫组化半定量法鉴定流感病毒感染后PKR蛋白较正常组织蛋白表达水平低。4、为在体外水平揭示猪P58IPK对PKR的抑制作用,根据NCBI上猪PKR基因序列,设计引物,从猪淋巴结克隆得到目的片段,构建原核表达载体pGEX-PKR,筛选获得蛋白表达的最佳条件:0.2 mmol/L IPTG诱导6 h。这为后期纯化蛋白,做GST pull-down做好了铺垫。同时,构建真核表达载体pDsRed1-PKR,并瞬时转染SUVECs,为研究甲型流感病毒感染时PKR与P58IPK的相互作用打下了基础。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-22
  第一章 CDK9 基因研究进展  12-17
    1.1 CDK9 的结构  12-13
    1.2 CDK9 的活性调节  13-15
    1.3 CDK9 与病毒感染  15-16
    1.4 CDK9 的其它生物学功能  16-17
  第二章 PKR 基因研究进展  17-22
    2.1 PKR 的结构  17-18
    2.2 PKR 的活性调节  18-19
    2.3 PKR 与病毒感染  19-20
    2.4 PKR 的其它生物学功能  20-22
试验研究  22-56
  第三章 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染对猪CDK9 基因表达的影响  22-35
    3.1 材料  22-24
      3.1.1 毒株  22
      3.1.2 主要试剂和工具酶  22-23
      3.1.3 主要仪器设备  23
      3.1.4 主要试剂配方  23-24
    3.2 方法  24-29
      3.2.1 流感病毒人工感染仔猪  24
      3.2.2 石蜡切片制备  24-25
      3.2.3 HE 染色程序  25-26
      3.2.4 Real-time PCR 检测CDK9 的mRNA 表达  26-28
      3.2.5 免疫组化分析CDK9 蛋白表达  28-29
    3.3 结果分析  29-33
      3.3.1 HE 染色结果  29-30
      3.3.2 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后CDK9 基因mRNA 的相对表达量  30-31
      3.3.3 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后CDK9 阳性细胞的定位  31-32
      3.3.4 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染仔猪后CDK9 表达量的变化  32-33
    3.4 讨论  33-34
    3.5 小结  34-35
  第四章 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染对猪PKR 基因表达的影响  35-42
    4.1 材料  35-36
      4.1.1 主要试剂和工具酶  35
      4.1.2 主要仪器设备  35
      4.1.3 主要试剂配方  35-36
    4.2 方法  36-38
      4.2.1 Real-time PCR 检测PKR 的mRNA 表达  36-37
      4.2.2 免疫组化分析PKR 蛋白表达  37-38
    4.3 结果分析  38-40
      4.3.1 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后PKR 基因mRNA 的相对表达量  38-39
      4.3.2 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后PKR 阳性细胞的定位  39-40
      4.3.3 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后PKR 阳性细胞数量的影响  40
    4.4 讨论  40-41
    4.5 小结  41-42
  第五章 H3N2 和H1N1 甲型流感病毒感染后下调的PKR 基因的体外表达  42-56
    5.1 材料  42-43
      5.1.1 组织、菌种及载体  42
      5.1.2 主要试剂和工具酶  42-43
      5.1.3 主要仪器设备  43
    5.2 方法  43-50
      5.2.1 猪PKR 基因的实验克隆  43-46
      5.2.2 猪PKR 在大肠杆菌中的表达  46-48
      5.2.3 猪PKR 在SUVECs 中的表达  48-50
    5.3 结果分析  50-55
      5.3.1 目的片段扩增结果  50-51
      5.3.2 原核目的片段的扩增结果  51
      5.3.3 猪PKR 原核表达载体酶切鉴定结果  51-52
      5.3.4 SDS-PAGE 检测原核表达的目的蛋白结果  52-53
      5.3.5 真核目的片段的扩增结果  53
      5.3.6 真核载体双酶切鉴定结果  53-54
      5.3.7 pDsRed1-PKR 质粒转染SUVECs 的荧光显微观察  54
      5.3.8 PKR 融合蛋白的Western blot 检测  54-55
    5.4 讨论  55
    5.5 小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-65
致谢  65-66
个人简介  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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